中華鱘TaqMan 實時熒光PCR 檢測方法的建立

陳光哲， 鄭紅霞, 祝長青

(1.江蘇省農業科學院中心實驗室，江蘇 南京 210014； 2.南京農業大學,江蘇 南京 210095； 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001)

鱘類是現存起源最早的脊椎動物之一，是一億五千萬年前中生代留下的稀有古代魚類，其被譽為研究魚類和脊椎動物進化的“活化石”。在中國境內，分布著一些野生鱘魚，其中中華鱘是中國特有的珍貴鱘類，具有重要的科學價值和難以估量的生態、社會、經濟價值，有“水中大熊貓”之稱[1-5]。但是，近年來，由于水域污染、人為捕撈、水利工程的建設以及資源的過度開采等原因導致了中華鱘的數量急劇減少。中國已經將中華鱘列入《國家重點保護水生野生動物名錄》，并按照一級保護野生動物實施保護。2010年，國際自然保護聯盟紅色名錄也收錄其為極危物種[6-9]。因此，保護中華鱘迫在眉睫，而建立快速、靈敏、特異的中華鱘及其產品的檢測鑒定方法是保護和拯救這一珍稀瀕危“活化石”的有效技術措施之一。

近幾年來，一些水生生物的物種鑒定方法陸續在國內外研究中被報道，主要包括形態學鑒定[10]、同工酶電泳分析[11]、染色體組型分析[12]、COI基因分析[13]等。這些方法雖已被運用于多種水生生物的鑒定，但是在實際應用中仍然具有一定的局限性。形態學、同工酶鑒定等方法由于受到檢測對象需為活體條件的限制，無法應用在水產加工產品上；染色體組型分析、COI基因分析等方法也存在操作繁瑣、耗時過長等不足[10-13]。PCR(聚合酶鏈式反應,Polymerase chain reaction)技術以其靈敏度高、特異性強等優點脫穎而出，在近幾十年被全世界許多科研機構和實驗室所采用。尤其是實時熒光PCR 技術，實現了PCR技術從定性到定量的飛躍，既可省去普通PCR 檢測過程中PCR 產物后續的分析與驗證步驟(如凝膠電泳和探針雜交)，簡化檢測過程，又能夠減少試驗操作過程中的EB (溴化乙錠Ethidium bromide)污染，使試驗更具安全性，同時邊擴增邊檢測，還可以提高檢測速度[14-16]。因此，與常規PCR 相比，實時熒光PCR 技術具有準確性高、特異性強、自動化程度高、可有效解決PCR 污染等優勢[17-18]，已成為一種成熟的主流基因檢測平臺，并且應用在諸多領域，如食品安全檢驗、食品成分來源檢驗[19]等。

本試驗根據NCBI(美國國立生物技術信息中心，National center for biotechnology information)上已經公布的中華鱘D-loop基因的核酸序列，設計并篩選出特異性的引物和探針，建立中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法，為中華鱘的物種鑒定及種質資源保護提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 中華鱘供試樣品為漁業保護部門提供；西伯利亞鱘、達氏鱘、史氏鱘購自鱘魚養殖場，其他用于對照試驗的動物種類購自于南京農貿市場(表1)。

表1供試樣品的種類

Table1Speciesofsamples

序號樣品名稱序號樣品名稱序號樣品名稱序號樣品名稱1中華鱘13螃蟹25雞肉37蚌仔2史氏鱘14黃鱔26叉尾鮰魚38毛蚶3西伯利亞鱘15帶魚27梭魚39文蛤4河豚16黃顙魚28牛蛙40斑節蝦5蚌17鱸魚29螯花魚41小青龍蝦6牙鲆18魷魚30鯧魚42單環刺縊7斑馬魚19豬肉31黑魚43梅蛤8鱉20牛肉32黃魚44大閘蟹9鯉魚21羊肉33鳊魚45蝦蛄10河蝦22鴨肉34青魚46青蟹11對蝦23江白蝦35海蟹47梭子蟹12鯽魚24花蟹36香螺48克氏原螯蝦

1.1.2 菌株和質粒 pMD19-T克隆載體和感受態細胞DH5α，南京鐘鼎生物技術有限公司產品。

1.1.3 試劑 Tiangen海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit，目錄號：DP324)， Tiangen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANamp Agarose Gel DNA Purification Kit，目錄號：DP209)， AxyPrep質粒DNA小量試劑盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，目錄號：AP-MN-P-50)，普通PCR預混液SapphireAmp Fast PCR Master Mix(寶生物有限公司產品)，實時熒光PCR反應預混液CS qPCR Master Mix(上海輝睿生物科技公司產品)，中華鱘基因引物及探針(上海輝睿生物科技公司產品)。

1.1.4 儀器 NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific公司產品)，AQE -183-2全自動凝膠成像系統(Syngene公司產品)，LightCycler 480 II實時熒光PCR擴增儀(Roche公司產品)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 使用Tiangen海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取中華鱘及對照生物的DNA。

1.2.2 引物設計 根據NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列設計引物探針組合，上游引物F：5′- CAAGAACACAAGATTAATGAG -3′,下游引物R：5′- GATCAAGGTATGTCGATGACA -3′，熒光探針P：5′- 熒光基團-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-淬滅基團-3′，熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1。

1.2.3 重組質粒構建 以中華鱘DNA為模板，利用引物對其進行PCR擴增。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，應用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產物，將目的DNA片段經TA克隆連接至pMD19-T載體中，得到重組質粒。重組質粒轉化到感受態細胞DH5α內增殖，篩選陽性克隆，進行菌液PCR檢測，取約100 μl陽性克隆菌液送南京鐘鼎生物技術公司測序，以確定克隆片段序列的準確性。使用質粒提取試劑盒提取重組質粒，根據下列公式計算拷貝數：拷貝數=(質粒質量×6.02×1023)/(質粒分子堿基對數×324.50×2.00)。

1.2.4 TaqMan實時熒光PCR TaqMan實時熒光PCR反應體系為10 μmol/L上游引物1.0 μl，10 μmol/L下游引物1.0 μl，10 μmol/L探針0.6 μl，50 ng/μl DNA模板2.2 μl,2倍熒光PCR緩沖液12.5 μl，去離子水9.0 μl。反應體系終濃度為1倍熒光PCR緩沖液，上游引物0.40 μmol/L，下游引物0.40 μmol/L，探針0.24 μmol/L。反應條件為：預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 40 s，45個循環，在每次循環的退火延伸時收集熒光信號；40 ℃冷卻 30 s。反應結束后，運用配套軟件進行分析。

1.2.5 特異性評定 以中華鱘及對照生物的DNA為模板，并設置空白對照，進行TaqMan實時熒光PCR反應。

1.2.6 靈敏度測定

1.2.6.1 核酸濃度 以濃度為1.0×10-5ng/μl、 1.0×10-4ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-1ng/μl 的中華鱘DNA為模板，設置空白對照，進行TaqMan實時熒光PCR擴增。

1.2.6.2 重組質粒 以每1 μl拷貝數達到1個拷貝、101個拷貝、102個拷貝、103個拷貝、104個拷貝的重組質粒DNA為模板，并設置空白對照，應用建立的TaqMan實時熒光PCR檢測方法進行擴增。

1.2.7 TaqMan實時熒光PCR檢測方法的驗證 將本研究建立的實時熒光PCR檢測方法應用于全國多個省市采集的63個鱘魚樣品，以驗證該方法的特異性和靈敏度。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

對重組質粒進行克隆與測序，克隆片段序列與NCBI上中華鱘的D-loop基因序列比對，結果顯示能夠準確擴增出長度為489 bp的中華鱘D-loop基因，并且擴增片段成功與質粒載體連接形成長度為3 181 bp的重組質粒。重組質粒克隆片段測序結果如下：GATCAAGGTATGTCGATGACAAGTCAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAGAAATATAGGGCCTGTCCGACATAAGGGGGTAGGGGGTTTGTCGACAATAAACGCCCGCACCTCGAAGTTCATGTGGGGAGGCAAAATCAGGTCTTGTAAAACACTCTCATGTGTGGATGTTAGATATATGTCCTTGCATCATTCATTATTCATTCCTCCGAGCAGTTGTGTAATGTTCTACCTTGTTGTTCTTTTCTGAAGGAGTTCTACATGTCAGTGAATGGAAACCCAGATTAAAAGTGCCAAATGTTGACAAGATTCTTGGCATGTGGGGTCATGGATTTTACAGTATTTTTAACATCAATCATATGCCAGACATAGTTCAGTTATGGGGAGTTTAACTATTAATGGGCCTGAGATAGAAGCCAAATGCCAGTAATAGTTCAATTTTAGGTCTTTTACAGGTACTGTCCTTCATCTCATTAATCTTGTGTTCTTG提取的重組質粒DNA利用NanoDrop 1000 微量紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度，DNA的A260/A280平均值為1.77，DNA的平均濃度為2 789.3 ng/μl。重組質粒DNA的濃度稀釋至28.0 ng/μl，根據公式計算拷貝數，相當于1 μl溶液中含有 8.16×109拷貝重組質粒DNA，用超純水將重組質粒溶液稀釋成1 μl 108個拷貝， -20 ℃保存備用。

2.2 特異性

F-R-P引物/探針組合對試驗所檢測各物種的特異性試驗結果顯示，當使用引物和探針組合F-R-P對48種DNA樣本進行擴增時，只有在中華鱘的DNA樣本出現擴增曲線，而在其他物種中沒有出現擴增曲線。因此建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法具有高度的特異性。

2.3 靈敏度

2.3.1 核酸濃度 應用建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法對倍比稀釋的中華鱘DNA進行擴增，結果見表2。試驗結果顯示中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達到1.0×10-3ng中華鱘DNA。

表2中華鱘TaqMan實時熒光PCR體系的靈敏度(核酸濃度)的Ct值

Table2TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(theconcentrationofnucleicacids)

NDA質量(ng)Ct值0．1000029．360．0100032．750．0010034．770．00010-0．00001-空白對照-

2.3.2 重組質粒 應用建立的F-R-P檢測體系對重組質粒DNA進行靈敏度的檢測，擴增檢測結果見表3。試驗結果顯示中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達到100拷貝的重組質粒DNA。

2.4 檢測方法的驗證

將本研究建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法應用于全國多個地區采集的63個鱘魚樣品中，檢測結果顯示：許多餐館中號稱的“中華鱘”其檢測結果不是真正的中華鱘，而只是其他的一些鱘魚品種。其中7個從相關科研單位得到已經鑒定的中華鱘標本，經檢測才是真正的中華鱘，檢測曲線圖譜如圖1所示。

表3中華鱘TaqMan實時熒光PCR體系的靈敏度(重組質粒)的Ct值

Table3TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(recombinantplasmid)

重組質粒拷貝數Ct值1000030．68100033．9910038．9510-1-空白對照-

圖1 部分鱘魚樣品的檢測曲線Fig.1 The amplification curves of some sturgeon samples

3 討 論

目前建立的中華鱘物種鑒定方法主要包括形態學鑒定、同工酶電泳分析、染色體組型分析、COI基因分析等方法，然而上述方法均存在某些局限性，不能對中華鱘及其產品進行快速而準確的檢測。因此為給中華鱘提供及時而有效的保護，建立中華鱘及其產品的快速檢測方法是十分必要的。

實時熒光PCR技術在近年來發展迅速，已成為目前應用較為廣泛的一種檢測方法。實時熒光PCR技術中常用的熒光材料有SYBR Green染料、TaqMan探針、分子信標、熒光共振能量傳遞(FRET)探針、復合探針等[20]。其中，TaqMan探針是一種水解寡核苷酸探針，其序列與目標序列上下游引物之間的一段DNA模板完全互補，5′端標記報告熒光基團(Reporter)，3′端標記淬滅熒光基團(Quencher)，每擴增1條DNA鏈，就會有1個TaqMan探針被水解下來，并隨之釋放出一個熒光信號，熒光信號的積累與PCR產物的增加是同步進行的[20]。TaqMan實時熒光PCR檢測技術能夠避免非特異性產物與探針的雜交，從而保證了檢測特異性[21]。目前該技術已經在多種動植物物種及其產品的鑒定方面得到了成功的應用[22]。

D-loop區是線粒體基因組上DNA序列和長度變異最大的一段非編碼區，各個物種的D-loop基因具有較好的特異性[23]。本研究根據NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列，應用分子生物學軟件設計并篩選出相應的引物和探針組合，經過TaqMan實時熒光PCR擴增和克隆測序，設計的引物和探針組合能夠特異、高效地擴增靶序列，擴增產物(長度為489 bp)測序結果與 NCBI上中華鱘D-loop基因序列一致。

本研究所建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法，應用于大量實際樣品后的試驗結果均符合預期，充分證實了該方法可以應用于中華鱘的物種鑒定，該檢測方法特異性好、靈敏度高、可操作性強，具有較好的應用和推廣價值，可以為中國中華鱘的鑒別以及物種資源保護工作提供可靠的技術支撐。

參考文獻:

[1] 王有基，袁明哲，吳芳麗，等． 長江流域中華鱘保育進展、存在問題及對策分析[J]．生物學通報，2005，48(12) :1-5．

[2] HU J Y, ZHANG Z B, WEI Q W, et al. Malformations of the endangered Chinese sturgeon,Acipensersinensis, and its causal agent [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106: 9339-9344.

[3] 楊 志，陶江平，唐會元，等. 三峽水庫運行后庫區魚類資源變化及保護研究[J]．人民長江，2012，43(10):62-67．

[4] 程金成，高 健，劉 健.中華鱘資源現狀及其保護對策探討[J].漁業現代化，2005(3):3-4.

[5] 常劍波，曹文宣.中華鱘物種保護的歷史與前景[J].水生生物學報，1999，23(6):712-719.

[6] 鄧 昕，鄧中磷.中華鱘的保護生物學研究進展[J].動物學研究，1997，18(1):113-120.

[7] 胡小琴，姜翠玲，裴海峰，等.水環境變化對中華鱘的影響[J].水電能源科學，2009,27(3):35-37.

[8] 柯福恩.論中華鱘的保護與開發[J].淡水漁業，1999，29(9):4-7.

[9] 姜禮燔.環境污染對中華鱘AcipensersinensisGray 影響的研究[J].現代漁業信息，1996，11(7):1-7.

[10] 魏開建，熊邦喜，趙小紅，等． 五種蚌的形態變異與判別分析[J]．水產學報，2003，27(1):13 -18．

[11] 高保全，劉 萍，李 健，等． 三疣梭子蟹野生群體同工酶的遺傳多態性分析[J]．水產學報，2007，31(1):1-6．

[12] GRAZYNA F S, FOPP B D, JANKUN M, et al. Note on the karyotype and NOR location of Siamese fighting fishBettasplendens(Perciformes, Osphronemidae) [J].Caryologia, 2008, 61(4):349-353.

[13] 柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，等. 基于線粒體CO1基因的DNA條碼在石首魚科(Sciaenidea)魚類系統分類中的應用[J]. 海洋與湖沼，2010，41(2):223-231.

[14] 陳 旭，齊鳳坤，康立功，等. 實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J]. 東北農業大學學報，2010，41(8):148-155.

[15] OKUMA T A, HELLBERG R S. Identification of meat species in pet foods using a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay [J]. Food Control, 2015, 50: 9-17.

[16] K?PPEL R, BUCHER T, FREI A, et al. Droplet digital PCR versus multiplex real-time PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769, MON87708, MON87705 and FG72, andlectin[J]. European Food Research and Technology, 2015, 241(4): 521-527.

[18] PAN A, YANG L, XU S, et al. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3’-transgene integration sequence [J]. Journal of Cereal Science, 2006, 43(2): 250-257.

[19] 吳永彬，肖維威，馬文麗. 實時熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測領域中的應用[J]. 生物技術通訊，2011，22(4):575-579.

[20] GOMEZ D K，SATO J，MUSHIAKE K，et al． PCR based detection of betanodaviruses from cultured and wild marine fish with no clinical signs[J]． J Fish Dis，2004，27(10):603-608．

[22] SCHOLTENS I M J, PRINS T W, RAAMSDONK L W D V．Specificity of a novel TaqMan PCR method for detection of poultry DNA [J].Food Control, 2017，73: 532-539．

[23] 黃志堅，徐曉鵬，唐晶晶，等．淡水魚類線粒體DNAD-loop基因的引物設計和應用[J]．中山大學學報(自然科學版)，2009，48(4) : 84-88．