奶牛結核病皮內變態反應和γ-干擾素法檢測對比實驗

李建華劉琴周亞平張泉鵬 張利坤施開平李春

（1，云南省安寧市畜牧獸醫站 650300；2，云南省昆明市動物衛生監督所 650041）

牛結核病是由牛型分枝桿菌等引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病，我國列為二類疫病。根據 《牛結核病防治技術規范》，對其采取 “監測、檢疫、撲殺、消毒和凈化”相結合的綜合性防治。檢疫方法以牛型PPD變態反應為主。據報道變態反應結果受奶牛健康狀況、環境因素的影響，非結核分枝桿菌、禽結核感染，常造成假陽性結果。目前，新的檢測方法γ-干擾素雙夾心法ELISA法已被世界動物衛生組織 （OIE）認可，并作為唯一的輔助診斷使用，在歐盟、美國、澳大利亞和新西蘭被批準為正式試驗。γ-干擾素ELISA原理是結核菌素PPD抗原刺激淋巴細胞后，感染牛結核分枝桿菌的細胞就能產生IFN-γ，并基于單克隆抗體的夾心ELISA檢測到。未感染牛結核分枝桿菌的淋巴細胞不會產生IFN-γ，因此，γ-干擾素的檢測與牛結核分枝桿菌感染相關。

本實驗通過比對單純頸部皮試變態反應 （SCT）、比較皮試變態反應 （CCT）與γ—干擾素釋放實驗 （IGRA）之間的差異，為臨床實際應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 PPD與試劑盒

皮膚實驗用牛型PPD、禽型PPD、牛結核伽馬干擾素ELISA檢測試劑盒購自瑞士Prionics公司。

1.2 實驗用牛

為安寧市某奶牛養殖小區隨機挑取75頭奶牛，同時進行禽結核PPD、牛結核PPD皮內變態反應，每頭牛分別注射牛型、禽型結核菌素0.1ml，72、96h觀察結果，計算皮厚差。SCT判定標準：皮厚差超過4mm判為陽性，2～4mm為可疑，小于2mm為陰性。

CCT判定標準：如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超過4mm判為陽性，1～4mm為可疑，小于或等于禽型PPD的皮厚差為陰性。

1.3 牛γ-干擾素實驗

采集奶牛頸靜脈血5ml，置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運送到實驗室，在采血后8h內進行刺激培養。操作參照試劑盒說明書進行。結果判定標準：牛型PPD OD值-PBS OD值≥0.1，且牛型PPD OD值—禽型PPD OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD OD值—PBS OD值＜0.1或牛型PPD OD值—禽型PPD OD值＜0.1判為陰性。

2 結果與討論

2.1 SCT、CCT、IGRA3種方法陽性檢出率

75頭牛的檢疫結果為SCT的檢出率為19.0%、CCT的檢出率13.3%、IGRA的檢出率為25.3%，見表1。IGRA的檢出率高于SCT、CCT，與石琴等的結論相符[1]。由于PPD變態反應是一種遲發型超敏反應，與機體的健康狀況有關，體制較差的奶牛反應較慢或者反應強度低。而γ-干擾素ELISA法直接刺激可以檢測結核病的期感染。用澳大利亞、美國、愛爾蘭、新西蘭、意大利和西班牙的13000頭牛進行田間試驗，結果表明，在γ-干擾素ELISA法診斷牛結核病時更敏感，能檢出早期感染牛。

表1 SCT、CCT、IGRA3種牛結核病檢疫方法比較

2.2 方法符合率

SCT、IGRA、CCT的結果見表2、表3。

表2 SCT、IGRA二種方法陽性結果比較

表3 CCT、IGRA二種方法陽性結果比較

75頭牛中SCT、IGRA共同陽性為7頭，陽性符合率為36.8%(7/19)， 陰性符合率91.0% （51/56）。

CCT、IGRA兩種方法的符合率，75頭牛中共同陽性為7頭，陽性符合率為 36.8%(7/19)，陰性符合率94.6% （53/56）。與陳祥、倪谷音、鄧永強的結果差異較大[2-4]，差異來源于奶牛體況，試劑盒差異，以及操作規范性。

CCT與SCT相比，陽性奶牛數減少2頭，陽性符合率100% （10/10）， 陰性符合率 96.9% （63/65），SCT假陽性率為16.7% （2/12），即采用CCT法可以減少由于禽結核分枝桿菌造成的假陽性。

3 結論

（1）3種方法相比，本實驗IGRA的檢出率最高，SCT次之，CCT最低。因此，在奶牛檢疫中，為避免由于禽結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌造成假陽性導致的奶牛誤殺，應采取雙皮試法進行檢疫。另外，鑒于皮內變態反應不能診斷出早期感染的奶牛，對于檢出可疑的奶牛應在3個月內復檢，每年開展2次檢疫，對檢出的陽性牛按規定進行處置，并嚴格按照要求對結核病陽性牛進行隔離、撲殺，對養殖場進行徹底消毒，堅持自繁自養，經過幾年就可以凈化奶牛養殖場結核病。

（2）γ-干擾素ELISA法能檢出早期感染的奶牛，在體外避免繁瑣操作造成的誤差，可操作性很強。但該法也存在不足之處，即試劑盒價格高，按一個試劑盒做480頭奶牛計算，一頭牛需要試劑費用70元以上，是皮內變態反應的10倍。因此，在采用γ-干擾素ELISA法時，最好先進行雙皮試反應，陽性奶牛再進行采用γ-干擾素ELISA法復查，均為陽性的采取撲殺措施。

（3）本實驗在進行γ-干擾素ELISA時還發現，該法對檢測人員的熟練操作性要求很強，加樣量和速度快慢、試劑加注、洗板、反應時間等均會影響檢測的重復性。重復性不好時，同一個樣品OD可能大于或小于0.1，造成判斷的誤差。因此，在進行γ-干擾素ELISA法操作時，要嚴格按照操作步驟進行，最好每個樣品做重復。

參考文獻:

[1]石琴,袁立崗,蒲敬偉,等.不同監測方法在奶牛結核病檢疫中的應用[J].中國奶牛,2017(1):33-35：

[2]陳祥,徐正中,時振華,等.γ-干擾素試驗和皮試變態反應對檢測奶牛結核病的比較[J].中國人獸共患病學報,2011,27(2):97-100.

[3]倪谷音,毛愛民.γ-干擾素釋放法檢測奶牛結核病的比較試驗[J].中國動物檢疫,2014(1):64-66

[4]鄧永強,陽愛國,郭莉,等.應用皮內變態反應和γ-干擾素體外釋放試驗檢測奶牛結核病的比較研究[J].中國奶牛,2014(8):23-25.