產纖維素酶細菌菌株的分離鑒定及產酶條件優化

毛麗春,修立輝,胡 剛

(廣西師范學院 環境與生命科學學院,廣西 南寧 530001)

人類對于能源的需求不斷增加,化石能源作為人類最主要的消耗能源具有一次性、有限性等特點,其的燃燒對環境造成嚴重污染。這些因素導致一種可再生、可持續發展的能源物質將其取代。而將生物質通過酶轉化為糖再發酵成為乙醇被認為是產生燃料和化學物質的可行方案［1］。纖維素是具有高度結晶結構的物質,由D-葡萄糖通過β-1,4鍵連接而成的線性聚合物。其被一層堅硬的木質素層所圍繞,因此將纖維素水解成可利用的葡萄糖是非常困難的［2］。纖維素通過外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3種酶的協同作用水解成葡萄糖［3］。內切葡聚糖酶負責切割纖維素鏈內部β-糖苷鍵,外切葡聚糖酶負責切割纖維素鏈的末端產生纖維二糖,最后β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖形成葡萄糖［4］。纖維素酶同大多數酶類一樣,有自己特殊的活性區域［5］。其反應區域包含兩個部分,即供底物結合的糖類結合域和分解底物的催化域,兩個區域通過靈活的鏈接器連接［6-7］。目前發現能夠降解纖維素酶的種類有Bacillus sp.、Pseudomonas sp.、Paenibacillus sp.、Lysinibacillus sp.、Micrococcus sp.、Xanthomonas sp.、Brucella sp.和Vibrio xiamenensis等［8］。

本研究經過初篩及液體發酵搖瓶培養得到高產纖維素酶菌株,對該菌株進行形態學分析和分子生物學鑒定,并對其產酶條件進行了優化,以期為進一步研究細菌纖維素酶生產菌株降解纖維素的機制提供實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品(31份)：采集自廣西省富川縣西嶺山原始森林保護區；甘蔗渣：南寧市制糖廠；羧甲基纖維素鈉(carboxy methyl cellulose sodium,CMC-Na)、微晶纖維素：美國Sigma公司；2×Easy Taq聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)SuperMix(+dye)和DNA分子量Marker：北京全式金生物技術有限公司；脫氧核糖核酸(deoxyri bonucleic acid,DNA)回收純化試劑盒：北京博邁德生物技術有限公司；四水合酒石酸鉀鈉、NaOH、Na2SO4、結晶酚和3,5-二硝基水楊酸(均為分析純)等：國藥集團化學試劑公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；細菌16SrRNA基因通用引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

初篩培養基：NaNO32 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,NaCl 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,KH2PO41.0g/L,酵母膏0.4g/L,甘蔗渣5 g/L,剛果紅0.2 g/L,瓊脂粉15.0 g/L,pH 5.0。

復篩培養基：KH2PO42.0 g/L,(NH4)2SO41.4 g/L,CaCl20.3 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,酵母膏0.4 g/L,微量元素溶液1 mL,瓊脂粉15 g/L,pH 5.0。

GBM培養基：牛肉膏2 g/L,酵母提取物2 g/L,蛋白胨5 g/L,蔗糖6 g/L,pH自然。另添加15 g瓊脂粉則為GBM固體培養基。112℃滅菌20 min。

液體發酵培養基：KH2PO41.5 g/L,Na2HPO41.3 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.7 g/L,CaCl20.1 g/L,微量元素溶液1 mL,CMC-Na10 g/L,pH7.0。

微量元素溶液組成：FeSO4·7H2O 0.005 g/L,MnSO40.001 6 g/L,ZnCl20.001 7 g/L,CoCl20.002 g/L。

1.2 儀器與設備

UV-5500(PC)紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；德安特ES-320分析天平：天津德安特傳感技術有限公司；Thermo ST8R臺式冷凍離心機：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ZWY-211B細菌培養搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；Gel K8160凝膠成像系統：北京科創銳新生物科技有限公司；DK-420S水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離和純化

以廣西省賀州市富川瑤族自治縣西嶺山原始森林保護區為采樣地,選取該區域土壤腐殖質區域表層2～20 cm處土壤進行采集,每個土樣點大約采集50 g土壤并編號同時記錄周圍植被類型情況。將采集土壤各稱量5g分別加入盛有50 mL蒸餾水的三角瓶中(250 mL),加入適量的玻璃珠,180r/min、28℃振蕩30min。將打散混勻的土壤梯度稀釋至10-1、10-2、10-3,每個梯度取100 μL混合液涂布于以甘蔗渣為唯一碳源的剛果紅培養基中培養。將所有能夠生長的菌株都轉移到以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養基中進行第二次初篩培養。培養48h后,使用0.2%的剛果紅進行染色,再用1 mol/L NaCl進行脫色。最后將所有能夠在第二次篩選培養基上生長的菌株進行液體發酵搖瓶培養。

1.3.2 16SrRNA基因序列的聚合酶鏈式反應擴增［9］

采用菌落PCR方式擴展16SrRNA的基因序列。PCR反應體系(25μL)：Template 1μL,F27/R1492引物各1μL,2×Taq PCR Mix 12.5μL,ddH2O 9.5μL。反應條件為：94℃預變性4 min,94℃變性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸90 s,進行30次循環,反應完后72℃再延伸10 min,PCR產物8℃保溫60 min。

用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠驗證PCR產物,將驗證成功的PCR產物進行純化并測序。利用Cluster W軟件將測序拼接后的序列與GenBank中的相似序列進行多種比對,再通過MEGA6.0軟件中基于Kimura-2的Neighbor-Joining(NJ)法(bootsrap=500次)構建具有產纖維素酶活的菌株以及相關相似菌株的系統進化樹。

1.3.3 菌株的形態學觀察和生理生化鑒定

形態學觀察：將細菌接種于GBM培養基上,觀察其菌落形態并對其進行革蘭氏染色。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏細菌手冊》進行。

1.3.4 菌株產酶條件優化

分別考察培養基碳源(麥麩、1%CMC-Na、濾紙和微晶纖維素)、氮源(胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3、酵母粉、牛肉粉、NH4Cl、NaNO3、尿素)、初始pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5),接種量(2%、4%、6%、8%、10%(V/V))對菌株XI31-1產酶的影響。

1.3.5 菌株XI31-1的CMCase酶學特性分析

分別考察菌株XI31-1產CMCase的最適pH及溫度。

1.3.6 測定方法

纖維素酶活的測定：按照參考文獻［10-12］的方法分別檢測內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、濾紙酶的酶活力。

2 結果與分析

2.1 土壤中產纖維素酶細菌的分離及純化

從西嶺山原始森林土壤分離產纖維素酶活的菌株,經過初篩獲得33株菌株,經過復篩僅有16株細菌能夠生長。

通過菌落PCR的方法將第二次初篩得到的16株細菌的16SrRNA基因片段進行擴增,用瓊脂糖凝膠電泳驗證其PCR產物,結果見圖1。

圖1 細菌16S rRNA PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of 16S rRNA of bacteria

由圖1可知,表明所得片段大小約為1.5 kbp。將得到的PCR產物純化后送武漢金開瑞生物工程有限公司測序。將測序得到的16S rRNA基因序列通過BLASTN分別在GenBank中進行比對,結果見表1,根據結果構建了系統進化樹見圖2。

表1 16株細菌產纖維素酶活及鑒定結果Table 1 Cellulase activity and identification results of 16 bacteria strains

圖2 16株細菌系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16 bacteria strains

由表1、圖2可知,16株菌株分屬于3個不同的屬：伯克霍爾德菌屬(Burkholderium 87.5%)、克呂沃氏菌屬(Kluyvera 6.25%)、Paraburkholderia(6.25%),伯克霍爾德菌屬菌株為西嶺山中降解纖維素酶的優勢菌群。16株細菌中僅菌株XI31-1具備產纖維素酶能力,故選擇菌株XI31-1進行后續實驗。

2.2 菌株的形態學觀察和生理生化鑒定

2.2.1 形態學觀察

圖3 菌株XI31-1的菌落形態(a)及菌株形態(b)Fig.3 Colonial(a)and morphology(b)of strain XI31-1

由圖3可知,菌株XI31-11在GBM平板上呈乳白色,圓形,邊緣完整,凸的,不透明,屬革蘭氏陰性菌。

2.2.2 生理生化鑒定實驗

表2 菌株XI31-1的生理生化實驗鑒定結果Table 2 Identification results of physiological and biochemical experiments of strain XI31-1

由表2可知,菌株XI31-1符合伯克霍爾德菌屬的脂肪酶陽性和不利用麥芽糖等生化特征,為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)。

2.3 產酶條件優化

2.3.1 不同碳源對菌株XI31-1產酶的影響

在菌液接種量為4%,初始pH5.0,28℃搖床培養條件下,分別考察不同碳源對菌株XI31-1產酶的影響,結果見圖4。

由圖4可知,以麥麩和微晶纖維素為碳源時,其CMCase酶活力達到最高分別是2.5 U/mL和2.59 U/mL,濾紙次之,1%CMC-Na酶活力最低。鑒于麥麩和微晶纖維素為碳源時,其酶活力相差不大,但微晶纖維素價格昂貴,而麥麩廉價且環保,故選擇麥麩作為該研究的碳源。

圖4 不同碳源對菌株XI31-1產酶的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on enzyme production by strain XI31-1

2.3.2 不同氮源對菌株XI31-1產酶的影響

圖5 不同氮源對菌株XI31-1產酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on enzyme production by strain XI31-1

由圖5可知,以酵母粉為氮源時其CMCase酶活力最高為2.76 U/mL。NH4Cl酶活力最低。因此選擇酵母粉為培養基的最佳氮源。

2.3.3 不同初始pH值對菌株XI31-1產酶的影響

圖6 初始pH值對菌株XI31-1產酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on enzyme production by strain XI31-1

由圖6可知,當初始pH值為7.0時,其CMCase酶活力最高為2.08 U/mL,繼續升高初始pH值后其CMCase酶活力不斷降低。因此選擇初始pH值為7.0。

2.3.4 不同接種量對菌株XI31-1產酶的影響

在不同接種量對菌株產酶影響的預實驗中,已證實當接種量為1%時,其CMCase酶活力低于接種量為2%的酶活力。由圖7可知,隨著接種量的不斷升高,其CMCase酶活力有降低的趨勢。因此選擇最佳接種量為2%。

圖7 不同接種量對菌株XI31-1產酶的影響Fig.7 Effects of different inoculum on enzyme production by strain XI31-1

2.4 菌株XI31-1的CMCase酶學特性分析

2.4.1 CMCase的最適pH值

在pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下分別測定CMCase酶活。以最高酶活力為100%,計算各pH值條件下的CMCase相對酶活力,結果見圖8。由圖8可知,CMCase酶活在pH值為5.0時最高。

圖8 不同pH值對CMCase酶活的影響Fig.8 Effects of different pH on CMCase activity

2.4.2 CMCase的最適溫度

圖9 不同溫度對CMCase酶活的影響Fig.9 Effects of different temperature on CMCase activity

在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下分別測定CMCase酶活。以最高酶活力為100%計算各溫度條件下的相對酶活力,結果見圖9。由圖9可知,CMCase酶活在溫度為60℃時最高。

2.5 討論

VARDAVKISE［13］研究認為纖維素酶的活力在春秋季節大于冬夏季節的活力,且深度為0～2 cm的森林土壤中有機物質的含量最高。有機物質和沙子內容物隨著土壤深度的增加而減少,但淤泥和黏土內容物隨著深度增加而增加。水解纖維素細菌的數量在0～2 cm的土壤中達到最大值,20～29 cm水解纖維素細菌的數量也處于最大值的狀態。YANG JK等［14］的研究表明,落葉闊葉林的有機營養物高于常綠闊葉林,在落葉闊葉林中纖維素降解菌的種群密度和種群多樣性高于常綠闊葉林,但常綠闊葉林更有可能含有高產纖維素酶的菌株。

對于產纖維素酶細菌菌株以及CMCase的研究中,AVELLANEDATORRESL M等［15］從哥倫比亞內瓦多斯國家自然公園篩選到了25株細菌,主要的產纖維素酶菌群是假單胞菌。SHAJAHAN S等［16］從印度中部馬哈拉施特拉邦區域的拉賈布爾西部海岸熱泉分離出的產纖維素酶菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。MAKIM L等［17］從造紙污泥和有機肥料中篩選到的主要纖維素酶菌群為乳酸菌和放線菌。HATEFIA等［18］從鞘翅目(Osphranteria coerulescens)昆蟲的消化道中篩選一株高產纖維素酶菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3 結論

從西嶺山原始森林保護區土壤中篩選到1株高產纖維素酶細菌菌株,鑒定其為伯克霍爾德氏菌。產酶條件優化結果表明其最佳碳源為麥麩,氮源為酵母粉,接種量為2%(V/V),初始pH 7.0,產酶時間為48 h,在最適條件下CMCase酶活最高可達2.76 U/mL。酶學特性研究顯示,在pH5.0,溫度60℃條件下CMCase酶活力最高。伯克霍爾德菌屬菌株為西嶺山中降解纖維素的優勢菌群。菌株XI31-1為高產纖維素酶菌株,為豐富產纖維素酶菌株庫提供價值。

參考文獻：

［1］KUHAD RC,DESWAL D,SHARMA S,et al.Revisiting cellulase production and redefining current strategies based on major challenges［J］.Renew Sust Energ Rev,2016,55：249-272.

［2］YANG W,MENGF,PENG J,et al.Isolation and identification of a cellulolytic bacterium from the Tibetan pig‘s intestine and investigation of itscellulaseproduction［J］.Electron J Biotechnol,2014,17(6)：262-267.

［3］LYNDL R,WEIMERPJ,VAN ZYL W H,et al.Microbial celluloseutilization：fundamentals and biotechnology［J］.Microbiol Mol Biol Rev,2002,66(3)：506-577.

［4］MOHAPATRA B R.Kinetic and thermodynamic properties of alginate lyase and cellulase co-produced by Exiguobacterium species Alg-S5［J］.Int J Biol Macromol,2017,98(Supplement C)：103-110.

［5］OBENGEM,BUDIMANC,ONGKUDONCM.Identifyingadditivesfor cellulaseenhancement-A systematic approach［J］.Biocatal Agr Biotechnol,2017,11(Supplement C)：67-74.

［6］HASHIMOTOH.Recent structural studiesof carbohydrate-binding modules［J］.Cell Mol Life Sci,2006,63(24)：2954-2967.

［7］ICHIKAWA S,YOSHIDA M,KARITA S,et al.Carbohydrate-binding modules influence substrate specificity of an endoglucanase from Clostridium thermocellum［J］.Biosci Biotechnol Biochem,2015,80(1)：188-192.

［8］BEHERA B C,SETHIB K,MISHRA RR,et al.Microbial cellulases-diversity&biotechnology with reference to mangrove environment：A review［J］.J Genet Eng Biotechnol,2017,15(1)：197-210.

［9］陳忠翔,房志家,陳 婷,等.一種簡單高效的酵母單菌落PCR方法［J］.生物技術通訊,2013(2)：225-229.

［10］GHOSEK T.Measurement of cellulase activity［J］.Pure Appl Chem,1987,59(2)：257-268.

［11］RAWAT R T L.Purification and characterization of an acidothermophilic cellulaseenzymeproduced by Bacillussubtilis strain LFS3［J］.Extremophiles,2012,4(16)：637-644.

［12］FENG Y D C J,PANG H,ET AL.Cloning and identification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of theexpressed cellulases［J］.Appl Microbiol Biotechnol,2007,2(75)：319-328.

［13］VARDAVKIS E.Seasonal fluctuations of aerobic cellulolytic bacteria,and cellulase and respiratory activities in a soil profileunder a forest［J］.Plant and Soil,1989,115：145-150.

［14］YANG JK,ZHANG JJ,YU H Y,et al.Community composition and cellulase activity of cellulolytic bacteria from forest soils planted with broad-leaved deciduousand evergreentrees［J］.Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(3)：1449-1458.

［15］AVELLANEDATORRESL M,PULIDO CP,ROJASE T.Assessment of cellulolytic microorganisms in soils of Nevados park,Colombia［J］.Brazi J Microbiol,2014,45(4)：1211-1220.

［16］SHAJAHAN S,MOORTHY I G,SIVAKUMAR N,et al.Statistical modeling and optimization of cellulase production by Bacillus licheniformis NCIM 5556 isolated from the hot spring,Maharashtra,India［J］.J King Saud U-Sci,2017,29(3)：302-310.

［17］MAKIM L,BROEREM,LEUNG K T,et al.Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers［J］.Int J Biochem Mol Biol,2011,2(2)：146-154.

［18］HATEFIA,MAKHDOUMIA,ASOODEH A,et al.Characterization of abi-functional cellulaseproduced by agut bacterial resident of Rosaceae branch borer beetle,Osphranteria coerulescens(Coleoptera：Cerambycidae)［J］.Int J Biol Macromol,2017,103(Supplement C)：158-164.