兩種釀酒酵母混合發酵對赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分的影響

于亞敏,李 霞,唐國冬,楊繼紅,2,3*

(1.西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學 合陽葡萄示范站,陜西 合陽 715300)

釀酒酵母由于發酵力強,酒精轉化率高,耐受高濃度的糖、乙醇、SO2等,而在酒精發酵過程中占據主導地位［1-2］。釀酒酵母是影響葡萄酒的香氣最重要的因素之一［3］。研究表明,釀酒酵母產生的次級代謝產物能夠影響葡萄酒風味［4］,且不同的菌株會有不同的影響［5］。李景明等［6-7］研究發現,不同釀酒酵母單獨發酵的赤霞珠葡萄酒的主要香氣成分相同,但含量有顯著差異。

單一的商業釀酒酵母發酵使得葡萄酒的風格和潛力趨于同質化,為了使葡萄酒風格的多樣化,科研工作者嘗試非釀酒酵母和釀酒酵母混合發酵的研究［8-9］,而關于釀酒酵母混合發酵的研究報道較少。HOWELL K S等［10］通過代謝足跡法研究發現混合發酵的成品酒的香氣輪廓有別于單種釀酒酵母分別發酵后混合調配的葡萄酒香氣輪廓。SABERIS等［11］研究發現兩種勃艮第本土釀酒酵母混合發酵的霞多麗葡萄酒具有濃郁的甜果、草莓、青蘋果、梨和香蕉香氣,比其他6種商業釀酒酵母單獨釀制成品酒的香氣更為獨特和復雜。

釀酒酵母F15釀制的赤霞珠干紅葡萄酒香氣豐富,具有果香、油脂香、草香、酒香、花香,但花香、果香不突出［6,12］。釀酒酵母EC1118最初從香檳酒中分離得來,被廣泛應用于干白葡萄酒、起泡葡萄酒、蘋果酒以及甜酒的釀制,具有花香、果香味濃郁的香氣特征［13］。本研究以釀酒酵母F15單獨發酵為對照,通過添加不同比例的釀酒酵母EC1118和F15混合發酵赤霞珠干紅葡萄酒,探討釀酒酵母EC1118與F15混合發酵對赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分的影響,以期為混合釀酒酵母發酵的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：紅色釀酒品種赤霞珠,2015年10月采自陜西涇陽產區。原料糖度為210 g/kg(以葡萄糖計),酸度為7.90 g/kg(以酒石酸計)。

釀酒酵母EC1118：法國LALVIN公司；釀酒酵母F15：法國LAFFORT公司。

葡萄糖、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、五水合硫酸銅、酒石酸鉀鈉(均為分析純)：廣東光華科技股份有限公司；亞硫酸溶液(含6%SO2)：陜西省礦物化工所；果膠酶(酶活4 400 U/g)、澄清劑(魚膠、交聯聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土按一定比例混合)：法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設備

TraceDSQ氣質聯用(gaschromatograph-massspectrometer,GC-MS)儀：美國Thermo Finnigan公司；TurboMatrix 350熱解析儀：美國PerkinElmer公司；DB-Wax色譜柱(30 m×0.25mm×0.25μm)、UV-60紫外可見光分光光度計：美國安捷倫公司；聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)涂層覆蓋的攪拌棒(Twister)(10 mm×0.5 mm)：德國Gerstel公司；5804R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；XC-310 4℃醫用冷藏箱：澳柯瑪醫療器械有限公司；GC-17蒸餾裝置：鄭州中天實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠干紅葡萄酒的釀造

釀造工藝［14］：取成熟度良好、果粒完整的赤霞珠葡萄共84 kg,等量分裝于12個10 L窄口玻璃發酵罐中,手工破碎,破碎度50%,留取適量的上清液測定葡萄汁的糖酸含量。破碎完畢,立即添加亞硫酸溶液,使SO2質量濃度達到50mg/L。試驗設計目標酒精度為13%vol,按照17.5g糖轉化為1%vol的酒精度進行換算,補加蔗糖調整葡萄汁糖度至227.5 g/L。在添加亞硫酸溶液1 h后添加果膠酶20 mg/L。靜置24 h后,以釀酒酵母F15單獨發酵為對照,添加不同比例菌株EC1118和F15(1∶9、3∶7和5∶5)的經活化的酵母共200 mg/L,啟動發酵,并控制發酵溫度為28℃。每天檢測3次發酵液的溫度、比質量,待比質量降至1.010時分離皮渣并輕微壓榨,混合自流汁和壓榨汁,繼續發酵至比質量降至0.992～0.996并保持2 d恒定后,膨潤土下膠,24 h后分離清液,并立即添加亞硫酸溶液,使SO2質量濃度達到50 mg/L,裝罐密封置于4℃冷庫貯藏3個月后,再裝瓶置于4℃冷庫貯藏3個月后測定各個指標。

1.3.2 基本理化指標的測定

還原糖和總糖(以葡萄糖計)：采用直接滴定法；總酸(以酒石酸計)和揮發酸(以醋酸計)：采用指示劑法；酒精度和干浸出物：采用密度瓶法。以上檢測方法均參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［15］中的方法進行。試驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。

1.3.3 香氣成分測定

采用攪拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)提取赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分,具體方法參考李娜娜等［16］的方法。

TurboMatrix 350熱解吸儀分析條件：以氦氣(He)為載氣,脫附流速設為45 mL/min,加熱閥溫度設為245℃,脫附管溫度為270℃,脫附15 min；傳輸線溫度為255℃。冷阱捕集溫度設為-30℃,以40℃/min升至255℃(二級解吸冷阱溫度)；出口分流比為3∶1,進樣He流速為1 mL/min。

GC條件：DB-WAX色譜柱(30 m×0.25mm,0.25μm)以氦氣(He)為載氣,流速設為1mL/min。升溫程序為40℃保持3min,以4℃/min升至160℃,7℃/min至230℃,保持8 min,連接桿溫度設為230℃。

MS條件：全掃描范圍為33～450 amu,每秒掃描1次。以電子電離(electron ionization,EI)為電離源,離子源溫度230℃,電子能量70eV,燈絲流量0.2mA,檢測器電壓350V。

定性定量：數據圖譜經計算機圖譜軟件XcaLibur系統分析與美國國家標準技術研究所(national instituteof standardsand technology,NIST)2005標準譜庫NIST Chemistry(http：//webbook.nist.gov/chemistry)相匹配,結合標準物質保留指數定性。以2-辛醇為內標物(質量濃度1 170μg/L),采用內加標準法定量計算各成分含量［6］,即檢出成分峰面積與內標物峰面積的比值,乘校正因子和內標物質量濃度,對于無標準物質的揮發性成分,計算時,采用與其化學結構相似物質的校正因子。

1.3.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2010進行計算,用SPSS 19.0軟件進行方差分析(analysis of variance,ANOVA),多重比較(multiplecomparison,MC)和主成分分析(principal componentanalysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母混合發酵對赤霞珠干紅葡萄酒理化指標的影響

由表1可知,4組不同比例混合酵母所釀的葡萄酒的還原糖含量均＜2 g/L,發酵徹底,揮發酸含量均＜0.4 g/L,沒有發生破敗,總酸含量均在6.50 g/L左右,性質穩定；混合組的還原糖含量顯著低于對照組(P＜0.05),說明釀酒酵母混合發酵提高了葡萄汁中還原糖的利用率。各組的酒精度在13.10%vol～11.50%vol之間,其中菌株EC1118和F15比例為1∶9和3∶7組所釀葡萄酒的酒精度顯著高于對照組和5∶5組(P＜0.05),說明適宜比例的混合釀酒酵母發酵能夠提高酒精的轉化率,這與酵母EC1118有較強葡萄糖和果糖利用能力以及酒精生成能力的文獻報道相一致［13］。5∶5組所釀葡萄酒的還原糖、總糖含量和酒精度均較低,而干浸出物含量顯著的高于1∶9和3∶7組的,與對照組的差異不顯著。釀酒酵母EC1118和F15混合發酵的赤霞珠干紅葡萄酒基本理化指標結果均符合國家標準GB/T 15037—2006《葡萄酒》［17］,且比例為1∶9和3∶7時,酒精度顯著增高(P＜0.05)。

表1 混合釀酒酵母發酵釀制的赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.2 釀酒酵母混合發酵對赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分的影響

通過GC-MS對4組不同比例混合酵母所釀葡萄酒的香氣物質進行定性、定量分析,共得到46種揮發性物質(見表2),包含酯類物質24種,醇類物質7種,酸類物質11種,酮類物質3種,及烯烴類物質1種。對照組和菌株EC1118和F15比例為3∶7組的香氣成分種類最多(均為40種),5∶5組的次之(33種),1∶9組的最少(27種)；3∶7組的香氣成分總量顯著高于其他組(P＜0.05)。在混合發酵過程中,酵母菌間會相互占有或者利用異己菌株分泌的中間代謝產物［10］,這使得本研究中混合組的香氣在種類上等于或者少于對照組,而含量上要多于對照組。因此,釀酒酵母EC1118和F15混合發酵會使得成品酒的香氣種類減少,含量增加,當兩者混合比例為3∶7時,香氣含量增加的最多。

表2 釀酒酵母混合發酵釀制的赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分Table 2 Aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae μg/L

續表

酯類是葡萄酒中最重要的香氣物質［1,21-22］。由表2可知,對照組的酯類物質種類最多(21種),菌株EC1118與F15比例為3∶7組和5∶5組次之(18種、17種),1∶9組最少(14種)。混合組的酯類物質總量與對照組之間差異不顯著。3∶7組的酯類物質總量顯著高于1∶9組和5∶5組(P＜0.05)。這與混合酵母發酵過程中,酵母的酯酶活性與接種順序、酵母的生長狀況有關［1］。3∶7組中的辛酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、己酸異戊酯、乙酸苯乙酯和3-苯丙酸乙酯的含量顯著高于其他組(P＜0.05)。

高級醇是酵母通過艾利希途徑(Ehrlich Pathway)產生的重要香氣物質［23］,＜300 mg/L時賦予葡萄酒復雜感,＞400mg/L時會帶來不愉悅的風味［24-25］。由表2可知,混合組的醇類物質總量顯著高于對照組(P＜0.05),且含量均＜300mg/L。3∶7組的醇類物質含量顯著高于其他組(P＜0.05),其1-壬醇和苯乙醇的含量顯著高于其他組(P＜0.05),其金合歡醇含量顯著高于對照組和5∶5組(P＜0.05),其具有玫瑰、菩提花香氣［19］。

有機酸是保持葡萄酒平衡的主要物質［26-27］。由表2可知,3∶7組的酸類物質總量顯著高于其他組(P＜0.05)。3∶7組中壬酸、十一烷酸、月桂酸和油酸的含量較低但顯著高于其他組(P＜0.05)。短鏈、中鏈脂肪酸通常會給葡萄酒香氣帶來負面影響,卻是合成酯類物質的必不可少的前體物質［28-29］。3∶7組的辛酸含量顯著高于對照組(P＜0.05)。1∶9組的肉豆蔻酸的含量顯著高于其他組(P＜0.05)。

4組成品酒香氣中的酮類含量和種類都較少,且總含量存在顯著差異(P＜0.05)。3∶7組的酮類物質含量顯著高于其他組(P＜0.05),其大馬士酮的含量顯著高于其他組(P＜0.05),具有玫瑰花香、榅桲果香。僅在3∶7組中檢測到香葉基丙酮,其具有花香。而略有香味的角鯊烯在1∶9組中含量顯著高于3∶7組(P＜0.05)。4組香氣中,僅檢測出3種萜烯類香氣物質——香葉醇、大馬士酮和香葉基丙酮。

綜上所述,釀酒酵母EC1118和F15混合發酵得到赤霞珠干紅葡萄酒的酯類、醇類和酸類等香氣物質的含量均有所增加。當兩者的混合比例為3∶7時,香氣的含量顯著高于其他組(P＜0.05),果香、花香成分增加的最多。

選取對4組成品酒香氣貢獻較大的26種香氣物質的進行主成分分析,結果見圖1。由圖1可知,提取出的前兩個主成分對整體方差的累計貢獻達到86.66%,PC1和PC2的貢獻分別為45.54%和42.12%。3∶7組處于在果香和花香香氣成分密集的區域,即丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等成分分布的PC1與PC2的正半軸區域。5∶5組分布在香氣成分較密集的區域,與異戊醇的分布接近,這可能與酵母菌株的BAT1基因的過表達有關［3］。對照組和1∶9組與大多的香氣成分的分布較為疏遠。1∶9組與香葉醇和肉桂酸乙酯分布較近,對照組與乙酸異戊酯分布較近。由此可知,釀酒酵母EC1118和F15混合發酵對赤霞珠干紅葡萄酒中呈果香、花香的揮發類香氣物質的影響較大,當兩者的混合比例為3：7時,成品酒香氣種類最為密集、復雜,果香和花香更為濃郁突出,香氣質量最佳。

圖1 混合釀酒酵母發酵的赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分主成分分析Fig.1 Principal component analysis of aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

3 結論

本研究以酵母F15單獨發酵為對照,添加不同比例的釀酒酵母EC1118和F15混合發酵得到赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標均符合國家標準,酯類、醇類和酸類等香氣物質的含量均有所增加。當菌株EC1118與F11的混合比例為1∶9和3∶7時,葡萄酒中酒精度顯著增高(P＜0.05)；且當二者比例為3∶7時,香氣成分總含量顯著高于其他組(P＜0.05),果香、花香香氣成分聚集。本研究為釀酒酵母混合發酵的開發和利用提供了參考。

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