桂枝茯苓膠囊抑制子宮內膜異位癥大鼠子宮內膜血管新生

劉明星 許 越 蔣亞玲 歐妙嫻

(廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產科，廣東 廣州 510150)

子宮內膜異位癥(EM) 是具有生長功能的內膜細胞在子宮腔內膜以外位置異位生長而形成的一種女性常見婦科疾病〔1，2〕。雖然目前EM的發(fā)病機制仍未闡明，EM發(fā)生發(fā)展有賴于血管生成和充足的血液供應，抗血管生成治療法已成為治療研究的新熱點〔2，3〕。《金匱要略》指出桂枝茯苓具有活血化瘀之功效，用于婦女血瘀、經閉及惡露等頑疾。本研究觀察caveolin-1的表達，探討桂枝茯苓膠囊對EM大鼠治療效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雌性、性成熟SD大鼠80只，體重200～220 g，清潔級，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。飼養(yǎng)室溫20℃～25℃，相對濕度50%～70%，實驗動物自由飲水飲食，每日觀察動物進食情況，稱體重，及時清理糞便。

1.2構建EM大鼠模型〔4〕篩選處于動情期大鼠(經陰道涂片檢查)，在造模前夜所有大鼠予以禁食，不禁水，術前對大鼠予以腹腔注射2%戊巴比妥鈉實施麻醉(120 mg/kg)，固定大鼠手術臺。取腹正中、恥骨聯(lián)合上2 cm切長2～3 cm切口進腹，取近端離右側子宮角1 cm處結扎，遠端離卵巢1 cm處結扎后切下大鼠子宮，置入無菌生理鹽水培養(yǎng)皿中，縱向剖開大鼠子宮分離，取組織剪剪取3塊3 mm×5 mm的子宮內膜組織備用。在腹壁切口右側從腹肌與皮下筋膜層之間剝離，置入子宮內膜片，取1塊子宮內膜組織平整置于剝離處底部，動態(tài)觀察，4 w后模型復制成功。

1.3分組處理 將造模成功的大鼠分為模型對照組、桂枝茯苓膠囊低、高劑量組各20只。桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組分別采用0.5、1.5 g/kg桂枝茯苓膠囊進行灌胃治療；空白對照組和模型對照組則以等量生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)28 d，結束治療后，處死大鼠，摘取異位子宮內膜，將每個標本切為4份，分別用于免疫組織化學和熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測。

1.4免疫組織化學染色與觀察 將組織切片至于68℃烤箱30 min，然后進行二甲苯脫蠟處理，梯度酒精脫水：二甲苯孵育5 min，棄去二甲苯，加入新的二甲苯繼續(xù)孵育5 min，無水乙醇洗滌3 min，無水乙醇Ⅱ洗滌3 min，分別95%、80%乙醇洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；以檸檬酸鈉為修復液，在高壓鍋內置入載有玻片的盒子進行熱修復，加熱至沸騰煮5 min后，停止加熱，冷卻至室溫；再予以甲醇-H2O2溶液避光修復15 min，以阻斷滅活內源性過氧化物酶對標本的破壞，PBS洗滌3次，每次3 min；按照1∶500的比例加入caveolin-1抗體，對石蠟組織切片進行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入辣根過氧化物(HRP)二抗，對石蠟組織切片進行室溫孵育40 min，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；再進行蘇木精復染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對染色后的切片進行梯度酒精水化處理，然后樹膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對組織切片中的血管內皮生長因子(VEGF)進行免疫組織化學染色觀察。

1.5熒光定量PCR檢測 取各組的組織切片，采用RNA提取試劑盒對各組織切片的RNA進行提取，所有操作嚴格按照提取試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明書進行。將提取得到的RNA進行體外反轉錄，采用miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen公司)操作說明書進行，使用20 μl反應體系進行實驗。反轉錄完成后，將反應液至于-20℃冰箱，以備下步定量PCR實驗；以U6為內參，對組織中caveolin-1及VEGF的表達進行熒光定量PCR操作，反應條件如下，預變性：95℃ 30 s，擴增(40個循環(huán))：94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，引物序列caveolin-1上游GGATGAGGATCACTGTTTTG、下游CCATTTGTCCACTGTAATT；VEGF上游AGAGGAAAGAGGTAGCAG、下游CCCAAAAGCAGGTCAGTC；β-actin上游ACCCGCGAGTACAACCTT、下游CATACCCACCATCACACC。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析，Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1caveolin-1、VEGF蛋白表達染色結果比較 caveolin-1蛋白主要表達在血管內皮細胞中，模型對照組caveolin-1陽性細胞數最少，28 d治療后，桂枝茯苓膠囊低、高劑量組caveolin-1陽性細胞數增加；VEGF在模型對照組中高表達，細胞陽性率較高，而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組VEGF陽性細胞數減少，見圖1。

圖1 各組caveolin-1、VEGF免疫組織化學染色結果(×400)

2.2caveolin-1表達定量比較 治療前模型對照組caveolin-1表達顯著低于空白對照組(t=13.89，P<0.05)，而與桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(F=2.456，P>0.05)；空白對照組及模型對照組治療前后caveolin-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組治療后caveolin-1的表達較治療前顯著升高(P<0.001)，相比于模型對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中桂枝茯苓膠囊高劑量組caveolin-1的表達水平顯著高于低劑量組(t=9.269，P<0.05)。見表1。

表1 各組治療前后caveolin-1、VEGF相對表達比較

與模型對照組比較:1)P<0.05；與空白對照組比較：2)P<0.05；與桂枝茯苓膠囊低劑量組比較：3)P<0.05

2.3VEGF表達定量比較 治療前模型對照組VEGF的表達顯著高于空白對照組(t=14.84，P<0.05)，而與桂枝茯苓膠囊低、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(F=0.014，P>0.05)；空白對照組及模型對照組治療前后、VEGF表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組治療后、VEGF表達較治療前顯著下降(P<0.001)，其中桂枝茯苓膠囊中高劑量組VEGF表達水平顯著低于低劑量組(t=3.141，P<0.05)。見表2。

2.4caveolin-1與VEGF表達相關性 caveolin-1與VEGF表達水平呈顯著負相關(r低劑量組=-0.65，P<0.05；r高劑量組=-0.61，P<0.05)，隨著caveolin-1表達水平的提高，VEGF的表達逐漸降低，見圖2。

圖2 桂枝茯苓膠囊低、高劑量組caveolin-1與VEGF的表達相關性

3 討 論

EM發(fā)生發(fā)展過程中新生血管的形成不僅能為異位病灶提供充足的氧氣，還可以維持其營養(yǎng)物質的供應，因而血管生成是異位病灶形成的重要條件〔5〕。血管生成是指從機體已存在的血管組織上產生新血管的動態(tài)過程，其中涉及多種細胞因子和生長因子參與調控，主要過程包括血管內皮細胞的增殖、遷移及分化過程等〔6，7〕。caveolin-1是內皮細胞的內源性蛋白，在內皮細胞中表達量較高，其在血管生成中的作用得到了廣泛的研究〔8，9〕。細胞周期分析證實高表達caveolin-1可以抑制VEGF引起的人臍靜脈內皮細胞增殖。實驗動物研究顯示caveolin-1與腫瘤及血管生成關系密切〔10〕。與野生型鼠相比，caveolin-1基因敲除鼠腫瘤血管通透性、腫瘤血管生成和腫瘤生長均增加〔9〕。這可能與在caveolin-1基因敲除鼠模型中，VEGF受體2磷酸化水平和內皮細胞一氧化氮(NO)合成酶(eNOS)活性升高有關〔10〕。在內皮細胞遷移過程中，caveolin-1也起著重要作用，當其表達水平下調后，內皮細胞移動受到抑制，可見caveolin-1可以促進內皮細胞遷移〔10，11〕。內皮細胞在生長未達到接觸抑制前，caveolin-1可以抑制內皮細胞的增殖，且caveolin-1表達在血管生成刺激因子作用下降低；內皮細胞生長達到接觸抑制狀態(tài)時，caveolin-1表達不受血管生成刺激因子作用的影響〔9〕。其中VEGF最為關鍵〔11〕，EM患者腹腔液中VEGF 的含量顯著高于正常婦女〔12〕。且EM嚴重程度與腹腔液中VEGF含量呈正相關〔13〕。

本研究表明EM大鼠子宮內膜組織中caveolin-1與VEGF可能通過其相互作用，參與子宮內膜血管新生的過程，這與文獻報道〔14〕也較為一致。

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