miR-21對急性胰腺炎腺泡細胞凋亡的影響及機制

劉 娜 姚艷粉 原 雙

(山東省交通醫院重癥醫學科，山東 濟南 250031)

急性胰腺炎(AP)根據嚴重程度分為輕癥、中癥和重癥AP，其中輕癥AP較為常見，預后良好，但重癥AP病情多變，常伴有局部并發癥和臟器功能衰竭，致死率高〔1〕。胰腺腺泡細胞凋亡與AP的發生發展關系十分密切，已成為AP發病機制及治療的一個研究熱點〔2～4〕。MicroRNA(miRNA)在機體生理活動中發揮重要的調控作用，其異常表達與多種疾病的發生發展關系緊密。有研究發現，miR-21在AP患者中存在低表達，且隨病情的發展而降低，與AP的發生與發展有密切關系〔5〕，但其對AP腺泡細胞凋亡影響的研究未見報道。本研究通過雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡AR42J細胞構建AP環境后，觀察miR-21表達，并通過脂質體轉染方式下調其表達后，觀察其對AR42J細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胰腺腺泡AR42J 細胞購于美國American Type Culture Collection公司。雨蛙素購于美國sigma公司，胎牛血清、RPMI1640培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青鏈霉素購于美國Gibco公司。腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購于上海普盛生物公司，淀粉酶(AMY)檢測試劑盒購于美國Bio Assay Systems公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑、Lipo2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司，β肌動蛋白(β-actin)抗體、第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切caspase)-3抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購于武漢博士德生物工程有限公司。RNA 提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、反轉錄試劑盒和電化學發光(ECL)試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，miRNA-21 inhibitor 購于上海吉瑪基因公司，RIPA細胞裂解液購于上海生工生物工程有限公司，NanoDrop2000和細胞培養箱購于美國Thermo公司，流式細胞儀購于美國BD公司，電泳儀和電轉儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及AP細胞模型構建 將AR42J細胞培養在加有RPMI1640培養基(含有10%的胎牛血清和抗生素)的培養瓶中，置于CO2濃度為5%的37℃恒溫培養箱中常規培養。造模前1 d，取6孔細胞板，將培養的AR42J以55 000個/孔進行接種，每孔加入1 ml RPMI1640培養基，置于培養箱中培養過夜。加濃度為15 nmol/L雨蛙素，震蕩混勻后，置于孵箱中培養至所需時間點(0、4、8、12和24 h)后收集上清液及AR42J細胞，備用。

1.2.2AMY、TNF-α和IL-6檢測 參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測上述雨蛙素處理后的AR42J細胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6的濃度。每組實驗均重復3次。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-21表達 將AR42J細胞轉移至1.5 ml的EP管，離心后棄上清。經PBS洗滌后，加入Trizol試劑抽提總RNA，并以NanoDrop2000定量。采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，并以其為模板鏈20 μl反應體系進行PCR擴增，反應體系：cDNA 1 μl，2×Master Mix 10 μl，F/R引物各0.5 μl，ddH2O 8 μl。擴增條件：預變性95℃ 6 min循環1次，變性95℃ 15 s循環40次，退火60℃ 60 s循環40次。以U6為內參，2-△△CT法進行分析。每組實驗均重復3次。

1.2.4轉染 在轉染前1 d，以6孔板接種550 000個雨蛙素處理過的AR42J細胞，隨機分為AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組。先以無血清培養基分別稀釋Lipo2000轉染試劑、miR-21 inhibitor和陰性對照miRNA，使miR-21 inhibitor和陰性對照miRNA終濃度為100 nmol/L。再將稀釋過的Lipo2000溶液與miR-21 inhibitor混勻加入AP+miR-21 inhibitor組細胞中，Lipo2000溶液與陰性對照miRNA混勻后加入AP+NC組細胞中，而AP組中只加入Lipo2000轉染試劑。置于孵箱中培養，待轉染6 h后，更換為完全培養基后再繼續培養48 h。

1.2.5流式細胞儀分析細胞凋亡 取1.2.1中未經雨蛙素處理的AR42J細胞(設為對照組)和上述轉染后培養48 h的AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組細胞，按照Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒說明書操作步驟檢測細胞凋亡率。每組實驗均重復3次，取均值。

1.2.6Western印跡檢測酶切caspase-3和PTEN蛋白表達 收集AP組、AP+NC組和AP+miR-21 inhibitor組細胞，經PBS洗滌后，離心棄上清。加入RIPA細胞裂解液提取總蛋白，并以BCA法進行定量。將配制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)放入盛有適量 1倍蛋白電泳緩沖液的電泳槽內，以每孔50 μg蛋白樣本上樣，進入分離膠之前采用90 V電壓，之后改用120 V電壓至電泳結束。采用半干法將蛋白凝膠轉至PVDF膜。轉膜2 h后，將膜取出，置于含有5% 脫脂牛奶的封閉液中常溫下反應2 h。加入1 000倍稀釋的一抗(酶切caspase-3抗體和PTEN)4℃下孵育24 h后，置于TBST溶液中以每次15 min洗膜3次，再置于2 000倍稀釋的二抗中37℃下反應2 h。經TBST液洗膜后，滴加ECL化學發光液顯色，Bio-Rad凝膠電泳成像儀掃描收集圖片，并以β-actin校正，Quantity One軟件分析目的蛋白的相對表達量。每組實驗均重復3次。

1.3統計學分析 運用SPSS22.0軟件進行t檢驗和多組間ANOVA分析。

2 結 果

2.1AP模型檢測 與0 h相比，雨蛙素處理4、8、12和24 h后，AMY、TNF-α和IL-6的表達均呈現先升高后下降的趨勢，且均在處理8 h時達到最大(P<0.05)。見表1。

表1 雨蛙素處理不同時間AR42J細胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6表達

與0 h比較：1)P<0.05

2.2miR-21在AP環境下低表達 與0 h(1.05±0.18)相比，AR42J細胞中miR-21的表達水平在4 h時(0.89±0.12)變化不明顯，但在8、12和24 h時(0.35±0.07、0.20±0.02、0.18±0.03)顯著降低(P<0.05)，且從1～24 h時間內miR-21的表達水平幾乎不變。

2.3miR-21抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡 未經雨蛙素處理的對照組AR42J細胞的凋亡率(8.37%±1.15%)較低，而經雨蛙素處理后的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與AP組(21.22%±2.76%)相比，AP+NC組(22.08%±3.14%)差異無統計學意義(P>0.05)，而AP+miR-21 inhibitor組(11.53%±1.32%)顯著降低(P<0.05)。

2.4miR-21對細胞中酶切caspase-3和PTEN蛋白表達的影響 AP組和AP+NC組中酶切caspase-3和PTEN蛋白表達水平基本相同，而AP+miR-21 inhibitor組酶切caspase-3蛋白表達水平明顯低于AP組，PTEN明顯高于AP組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Western 印跡檢測結果

組別酶切caspase?3PTENAP組032±003057±006AP+NC組035±002062±005AP+miR?21inhibitor組070±0061)118±0091)

與AP組比較：1)P<0.05

3 討 論

AP是一種急性病，盡管對其認知和治療隨著醫學領域的發展有所提高，但目前仍沒有有效的治療手段。AP的發生機制是一個多階段和多基因調控的復雜過程，AP的嚴重程度與胰腺腺泡細胞凋亡呈負相關〔6〕。AR42J細胞是一種來自大鼠胰腺腺泡細胞瘤的細胞，因其具有易培養、刺激反應大和轉染效率高等優勢，多用于AP細胞模型的構建〔7，8〕。

AP的發生和發展離不開miRNAs的調控〔9〕。miR-21是一種與炎癥關系極為密切的miRNAs，在巨噬細胞、T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和單核細胞等多種免疫細胞中均有表達〔10〕。miR-21的異常表達除與腫瘤的發生有關外，還有哮喘、心血管疾病和神經退行性疾病等有關〔11～13〕。已有研究證實，miR-21在肺鱗癌、大腸癌和肝癌等細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡過程中發揮重要作用〔14～16〕。Das等〔17〕指出，miR-21在機體受到重大創傷時會下降，恢復后則又增加。Sheedy〔10〕也指出miR-21在炎癥的平衡和機體功能恢復過程中發揮關鍵作用。近年來，有研究發現miR-21在AP中低表達，且與AP的病情發展關系密切〔5〕。本研究提示，AP中miR-21可能通過抑制AP腺泡細胞凋亡加重病情的發展。

caspase-3是公認的caspase-3家族中的執行凋亡蛋白，與AP的發生發展關系密切。黃亨燁等〔18〕研究發現，輕癥AP患者中caspase-3高表達，且隨著病情進展，Caspase-3表達減弱。PTEN是PI3K信號通路中一個重要的負調控因子，除在腫瘤中發揮抑增殖和促凋亡的抑癌作用外，也與炎癥的發生有關〔19〕。吳曉鵬等〔20〕發現，PTEN可能通過介導PI3K/AKT信號通路調控炎性通路TLR4-NF-κB，進而調控巨噬細胞介導的炎癥過程。資料顯示，PTEN是miR-21下游的靶基因〔21〕，因此推測miR-21可能介導PTEN在調控AR42J細胞凋亡過程中發揮重要作用。本研究進一步提示，在AP中，miR-21可能通過下調酶切caspase-3和上調PTEN蛋白表達抑制AP腺泡細胞凋亡，進而加重病情。

1IAP WG.Guidelines APAAP.IAP/APA evidence-based guidelines for the management of acute pancreatitis〔J〕.Pancreatology,2013;13(4):e1-15.

2Liu Y,Yang L,Chen KL,etal.Knockdown of GRP78 promotes apoptosis in pancreatic acinar cells and attenuates the severity of cerulein and LPS induced pancreatic inflammation〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e92389-97.

3Xu P,Lou X L,Chen C,etal.Effects of peroxisome proliferator-activated receptor-γ activation on apoptosis in rats with acute pancreatitis〔J〕.Dig Dis Sci,2013;58(12):3516-23.

4Lin Z,Guo J,Xue P,etal.Chaiqinchengqi decoction regulates necrosis-apoptosis via regulating the release of mitochondrial cytochrome c and caspase-3 in rats with acute necrotizing pancreatitis〔J〕.J Tradi Chin Med,2014;34(2):178-83.

5周慧明,付 萍,杜丹廷,等.血清胃腸激素及循環血microRNA與急性胰腺炎的相關性〔J〕.疑難病雜志,2015;14(5):462-3.

6朱 勇,崔建嬌,張明智,等.甘氨酸對重癥急性胰腺炎肺組織中髓樣細胞觸發受體-1mRNA及高遷移率族蛋白-1表達的影響及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(5):1055-6.

7Cao Y,Yang W,Tyler MA,etal.Noggin attenuates cerulein-induced acute pancreatitis and the impaired autophagy〔J〕.Pancreas,2013;42(2):301-7.

8付蘭英,饒春燕,趙曉晏.硫化氫對離體大鼠胰腺腺泡細胞炎癥因子表達的影響〔J〕.第三軍醫大學學報,2013;35(8):784-8.

9賈重陽,張辰龍,張小強.microRNAs在急性胰腺炎中的研究新進展〔J〕.中華衛生應急電子雜志,2017;3(3):180-2.

10Sheedy FJ.Turning 21:induction of miR-21 as a key switch in the inflammatory response〔J〕.Front Immunol,2015;6(19):1-9.

11劉蘭英,周 姍,王和生.微RNA在支氣管哮喘中與Th2相關促炎因子的研究進展〔J〕.醫學綜述,2015;21(23):4252-5.

12Quiat D,Olson EN.MicroRNAs in cardiovascular disease:from pathogenesis to prevention and treatment〔J〕.J Clin Invest,2013;123(1):11-8.

13Molasy M,Walczak A,Szaflik J,etal.MicroRNAs in glaucoma and neurodegenerative diseases〔J〕.J Human Gene,2017;62(1):105-12.

14Xu L,Wu Z,Chen Y,etal.MicroRNA-21(miR-21)regulates cellular proliferation invasion migration and apoptosis by targeting PTEN.RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma.Gejiu City.China〔J〕.PLoS One,2014;9(8):e103698-708.

15Xiong B,Cheng Y,Ma L,etal.MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3 K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(1):219-28.

16Najafi Z,Sharifi M,Javadi G.Degradation of miR-21 induces apoptosis and inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Gene Ther,2015;22(11):530-5.

17Das A,Ganesh K,Khanna S,etal.Engulfment of apoptotic cells by macrophages:a role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation〔J〕.J Immunol,2014;192(3):1120-9.

18黃亨燁,施 悅,陸丹妮,等.凋亡相關因子Caspase-3、Survivin在急性胰腺炎患者中的表達及意義〔J〕.臨床和實驗醫學雜志,2017;16(17):1665-8.

19蘇 強,李 浪.PTEN與炎癥關系的研究進展〔J〕.重慶醫學,2014;43(4):494-7.

20吳曉鵬,王選琦,李 妍,等.PTEN對ox-LDL誘導的巨噬細胞炎性因子的影響及機制研究〔J〕.心臟雜志,2014;26(6):646-51.

21Zhu HY,Li C,Bai WD,etal.MicroRNA-21 Regulates hTERT via PTEN in Hypertrophic Scar Fibroblasts〔J〕.PLoS One,2014;9(5):e97114-23.