miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1在人骨肉瘤中表達及臨床價值

劉 洋 董 平 郗 政 鄧志會 沈洪濤 張 彥 楊普程

(齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

骨肉瘤(OS)是來源于間葉組織常見原發惡性腫瘤，OS在每個年齡段均有發病，超過3/4患者為青少年，約1/4為老年患者，且男性多于女性〔1〕。OS容易發生血行轉移，5年生存率較低，約為20%。臨床的主要治療為手術聯合輔助化療，但療效不甚明顯，OS生存率提高到不足50%〔2〕。OS病變復雜，尚無一個完整體系概括，但病變多在癌細胞侵襲、轉移和自噬等方面，報道顯示，miR-195屬于微小RNA(miR)-15/16/195家族，在肝癌、結腸癌和非小細胞等多種惡性腫瘤中異常表達，參與癌細胞侵襲與轉移〔3〕；核糖體蛋白L34是核糖體蛋白 L34E家族成員，參與胃癌等惡性腫瘤細胞的增殖和抗凋亡過程〔4〕；自噬參與腫瘤細胞凋亡、耐藥及腫瘤干細胞分化增殖的調節，Beclin1作為重要的自噬相關因子，在自噬體形成過程扮演重要角色〔5〕。miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1是惡性腫瘤病變中研究較多的標記物。本研究擬分析人OS miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年4月至2012年6月齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院確診為OS的患者56例，年齡60～72歲。病變部位為股骨20例、肱骨15例、脛骨15例和腓骨6例。均接受常規化療聯合手術，手術為單純腫瘤切除術或關節置換術，手術前后均接受常規化療。選擇同期骨軟骨瘤患者35例，兩組一般臨床資料差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般情況比較

1.2排除標準 術前接受輔助治療；診斷時已出現癌轉移；預計存活時間≤6個月；存在精神障礙，不配合研究或資料不完整者。

1.3免疫組織化學染色檢測miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1的表達 石蠟切片常規脫蠟和水化，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原，冷卻至室溫以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，滴加 3%過氧化氫行過氧化物酶阻斷，PBS沖洗，滴加山羊血清封閉，去除封閉液，滴加一抗鼠抗人miR-195(1∶100)、核糖體蛋白L34(1∶20 )和兔抗人Beclin1(1∶200)，4℃孵育過夜，37℃復溫45 min，PBS沖洗，分別滴加抗鼠、生物素化和抗兔二抗(37℃孵育1.0 h)、PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，Mayer蘇木素復染，脫水，透明及封片，PBS緩沖液替代一抗作為對照。陽性及半定量判斷采用雙盲法由兩位病理科醫生獨立審閱所有切片。判斷標準：每個視野計數 100 個細胞，依據陽性細胞的比率及染色度進行判定。①陽性細胞比例評分：陽性細胞數/總細胞數<10%為0分；陽性細胞數/總細胞數10%～25%為1分；陽性細胞數/總細胞數26%～50%為2分；陽性細胞數/總細胞數>50%為3分。②染色深度評分：無染色為0分；淡黃色為1分，黃色至棕黃色為2分；深黃色至深棕黃色為3分。③總積分=陽性細胞比例評分+染色深度評分：0 分陰性(-)，≥1分陽性(+)。采用Microdensitometer對染色切片進行定量，每張切片測試5個區域，計算每個區域抗原的百分比，求均值，以每批切片的陰性對照調零，并對玻片校正厚度，消除玻片厚度對結果的影響。

1.4細胞壞死率為化療效果的判斷依據 化療前活檢標本和術后切除的瘤體均行HE染色，每張切片隨機取5個視野，計數存活的腫瘤細胞。腫瘤細胞壞死率=(化療前細胞數-化療后細胞數)/化療前細胞數×100%。細胞壞死率≥90%為化療效果良好，<90%為化療效果不佳。

1.5生存分析 完成最后一次化療作為隨訪時間起點，以復診、電話、微信和E-mail方式記錄所有患者出現復發、腫瘤轉移及死亡的病例。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行t、χ2檢驗，相關性行Spearman分析，生存率采用Log-rank檢驗。

2 結 果

2.1兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1分別在細胞質及細胞核表達。與骨軟骨瘤組比，OS組miR-195和Beclin1陽性或半定量表達明顯降低(P<0.001)，核糖體蛋白L34陽性或半定量表達明顯增高(P<0.001)，見表2、表3和圖1。

表2 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1陽性表達〔n(%)〕

表3 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1半定量表達

圖1 兩組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達(DAB，×200)

2.2OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1相關性 miR-195與核糖體蛋白L34和Beclin1分別呈負和正相關(r=-0.64,0.68,均P<0.05)，核糖體蛋白L34和Beclin1呈正相關(r=0.72,P<0.05)。

2.3miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與化療效果的關系 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達呈陰性、陽性及陰性者化療效果不佳，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與5年生存時間的關系 OS組均獲得5年隨訪，存活26例(46.43%)，死亡30例(53.57%)，轉移16例、復發12例、交通意外死亡1例、不明原因死亡1例。 miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達分別為陽性、陰性和陽性的患者5年生存時間均顯著較長(χ2=4.207,P=0.040；χ2=4.033,P=0.045；χ2=4.858,P=0.028)，見圖2。

圖2 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與5年生存時間

表4 OS組miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達與化療效果的關系〔n(%)〕

3 討 論

miR-195是基因轉錄后調控的非編碼小分子RNA，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發生等多種病理過程〔6〕。本課題結果提示miR-195在人OS病變中起保護作用，檢測癌組織miR-195表達可評估患者預后。研究顯示〔7～11〕，miR-195在結腸癌組織中的表達水平減少與結腸癌患者低生存率有明顯相關性，與miR-195具有抑制結腸癌癌細胞侵襲及遷移相關；原位雜交顯示miR-195在轉移前列腺癌組織中的表達顯著低于非轉移前列腺癌組織，在前列腺癌細胞中高表達的miR-195能夠抑制細胞的遷移和侵襲能力,同時上皮間質轉化常見標識蛋白波形蛋白及N-鈣黏素水平降低。miR195可作為靶向調控的化療干預。

核糖體蛋白L34 是一種保守的核糖體蛋白，在惡性腫瘤中均表現出核糖體外功能〔4,12,13〕，如人胃癌細胞株 SGC-7901 的核糖體蛋白L34 表達敲減可增加細胞凋亡，抑制細胞增殖，迫使細胞分裂周期阻滯在 S 期，核糖體蛋白L34 高表達可促進非小細胞肺癌細胞株H1299增殖，且在非小細胞肺癌組織呈現過表達，核糖體蛋白L34 在人胰腺癌組織和胰腺癌細胞株中過表達，參與抑癌基因 RPL34基因啟動子的甲基化過程，該過程降低了RPL34基因的抑癌作用。敲除核糖體蛋白L34可有效抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和耐藥性，致使胰腺癌細胞停滯于G2 期進而凋亡，可見核糖體蛋白L34參與癌細胞的增殖、周期及抗凋亡過程，上述作用可能與核糖體蛋白34 表達改變絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53 信號通路活性相關，MAPK/p53 信號有助于調控癌細胞的增殖及轉移〔14〕。本課題結果顯示核糖體蛋白L34在人OS呈高表達，參與人OS的發生發展過程。

Beclin1參與腫瘤細胞自噬，在腫瘤發生發展中發揮抑瘤和促瘤雙重作用〔5,15〕。一方面，Beclin1可通過增強腫瘤細胞的自噬活性，誘導腫瘤細胞自噬性凋亡，抑制腫瘤的發展。該作用較典型地表現在肝癌、卵巢癌和前列腺癌等惡性腫瘤中， Beclin1基因缺失或突變，Beclin1表達也呈下調狀態〔16,17〕。另一方面，Beclin1 可通過 PI3K 通路形成自噬復合物，抑制下游信號通路p53，抑制細胞凋亡，促進腫瘤發展，例如在胃癌和肺癌的表達是上調的，隨著腫瘤級別的增高而表達增高〔18〕。本課題Beclin1 陽性表達的OS患者5年生存率明顯高于陰性表達的患者，以往也有類似報道〔19〕，而且Beclin1 陽性表達的患者化療效果較好，差異無統計學意義，可能與納入案例較少有關。離體研究也顯示，Beclin1基因過表達可以激活人OS MG63細胞株的凋亡，抑制其增殖〔18〕。可見人OS中Beclin1依賴的腫瘤自噬表現出抑瘤機制，增強機體的依賴Beclin1 型腫瘤自噬有助于治療腫瘤，改善患者生存狀態。

綜上，人OS患者miR-195、核糖體蛋白L34和Beclin1表達水平與預后密切相關，miR-195和Beclin1表達水平越高，核糖體蛋白L34表達越低，預后較好。

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