葛根素對大鼠肝星狀細胞生長及NF-κB p65和TGF-β1表達的影響

雷凱雄 周清平 唐武成 楊 莉

(南華大學附屬第一醫院感染科，湖南 衡陽 421001)

肝纖維化是多種慢性疾病發展為肝硬化的中間病理過程，是細胞外基質合成和降解失衡致使其過渡沉積的結果；肝星狀細胞是細胞外基質的主要來源，該細胞的活化和增殖被認為是肝纖維化發生的關鍵因素〔1，2〕。肝纖維化是一種機體的慢性炎癥反應，炎癥過程在其發生發展過程中發揮重要作用〔3，4〕。肝星狀細胞是肝臟炎癥過程的靶細胞和效應細胞，它的活化過程受到多種信號通路和細胞因子的共同調控。核轉錄因子(NF)-κB是一種炎癥反應最為重要的轉錄因子，在肝臟炎癥反應活性氧、細胞因子和炎性因子等的產生和分泌過程中發揮重要的調控作用〔5〕。轉化生長因子(TGF)-β1是介導纖維化最關鍵的細胞因子，在細胞外基質代謝和激活肝星狀細胞方面發揮重要作用〔6，7〕。葛根素是一種在癌癥、糖尿病和心血管疾病等多種疾病中具有很好抗感染作用的常用中藥〔8〕。本研究旨在探討葛根素對肝星狀細胞生長及NF-κB p65、TGF-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑和儀器 大鼠肝星狀HSC-T6 細胞購于上海美軒生物科技公司，葛根素購于南京狄爾格公司。RPMI1640培養基和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，胰蛋白酶購于美國Hyclone公司，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑和Trizol試劑購于美國Inbitrogen公司，青鏈霉素購于杭州吉諾公司，一抗(NF-κB p65抗體和β-actin抗體)購于美國Abcam公司，二抗 〔辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔〕購于武漢博士德公司，總蛋白提取試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、細胞周期檢測試劑盒和電化學發光(ECL)檢測試劑盒購于南京碧云天公司。電泳儀和轉膜儀購于北京六一儀器廠，CO2培養箱購于美國Forma Scientific公司，酶標儀購于美國Bio-Tek公司。

1.2細胞處理 將復蘇后的HSC-T6細胞種植于含有RPMI1640培養基的培養瓶中，其中培養基中加有10%胎牛血清和1%青鏈霉素。放置于5%CO237℃恒溫細胞培養箱內培養，每2 d換液一次，觀察細胞生長至鋪滿瓶底70%左右時，開始加0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集穩定生長的對數生長期HSC-T6 細胞進行實驗。

1.3細胞增殖實驗 將上述收集的HSC-T6細胞，以每孔100 μl細胞懸液(細胞濃度為4.5×106個/ml)接種至96孔細胞板中培養，1 d后更換培養基。將HSC-T6細胞隨機分別溶劑組和葛根素組，其中，葛根素組包括0.1、1.0和10.0 μmol/L 3個不同濃度組，溶劑組中加入等量濃度為0.1% DMSO的培養基，每組設4個平行孔，重復3次，分別于培養箱內反應24、48和72 h。配制至所需時間后，加入20 μl MTT溶液，待反應4 h后，以酶標儀檢測各組的吸光度OD值(檢測波長為450 nm)。

1.4細胞周期實驗 取6孔細胞板，以每孔100 μl細胞濃度為5.0×106個/ml的懸液進行接種，在常規條件5%CO2和37℃細胞培養箱中培養過夜。根據1.3中的分組處理細胞，培養72 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心后，收集細胞，加500 μl預冷的70%乙醇，在4℃環境下反應4 h，離心棄上清，加RNase A 100 μl常溫反應30 min。再加碘化丙啶400 μl于4℃下避光反應30 min。于流式細胞儀上檢測各組HSC-T6細胞的周期分布情況。每組實驗均重復3次。

1.5酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測細胞中TGF-β1的含量 取對數生長期的HSC-T6細胞，經胰酶消化后，按照每孔100 μl(細胞濃度同上)接種到96孔板中，與細胞培養箱中常規培養過夜后，以葛根素按1.3中的分組處理細胞，再培養72 h后，離心收取上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測各組HSC-T6細胞中TGF-β1的表達情況。

1.6Western印跡檢測NF-κB p65蛋白的表達 將葛根素處理72 h后的HSC-T6細胞，以PBS洗滌后，加預冷的RIPA裂解液提取總蛋白，并以BCA法進行定量。取總蛋白樣品60 μg和5倍上樣緩沖液5 μl混合，置于沸水浴中變性10 min。在SDS-PAGE凝膠中上樣變性蛋白，電泳結束后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。以封閉液(含5%脫脂奶的粉TBST)作用2 h后，加NF-κB p65(1∶500稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)一抗4℃下孵育24 h。TBST洗膜后，加1∶5 000倍稀釋的HRP標記羊抗兔二抗，常溫孵育2 h。洗膜后，加ECL顯色定影。采用Band Scan軟件分析條帶，以β-actin作內參，計算各組HSC-T6細胞中NF-κB p65蛋白的相對表達量。

1.7統計學方法 運用SPSS21.0軟件進行t檢驗、One-way ANOVA和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1葛根素對HSC-T6細胞增殖的影響 MTT分析顯示，與溶劑組相比，不同濃度葛根素均能抑制HSC-T6細胞增殖(P<0.05)，且表現出一定的濃度-時間效應關系。在72 h時10.0 μmol/L葛根素處理下，HSC-T6 細胞OD值下降幅度最大。因此，選用72 h作用時間進行后續實驗。見表1。

表1 各組HSC-T6 細胞的OD值

與溶劑組比較：1)P<0.05；下表同

2.2葛根素對HSC-T6 細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，經葛根素處理后的HSC-T6 細胞的周期分布明顯發生了改變，細胞被阻滯于G0/G1期。與溶劑組比較，葛根素處理組中細胞在G0/G1期所占比例明顯升高(P<0.05)，而S期和G2/M期細胞比例明顯降低(P<0.05)，且隨葛根素濃度的增加，變化越顯著。見表2。

表2 各組HSC-T6 細胞的周期分布

2.3葛根素對HSC-T6細胞中TGF-β1表達及NF-κB p65蛋白的影響 與溶劑組相比葛根素處理組中TGF-β1含量隨葛根素濃度的增加而呈下降趨勢，NF-κB p65蛋白的相對表達水平明顯降低，且表現出一定的葛根素濃度效應關系(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 葛根素對各組HSC-T6 細胞中TGF-β1表達

圖1 Western印跡檢測NF-κB p65蛋白表達結果

3 討 論

肝纖維化的發病機制是一個復雜的過程，肝星狀細胞的異常增殖與活化是肝纖維化發生和形成的關鍵環節，因此抑制肝星狀細胞的生長是治療和改善肝纖維化的重要機制。葛根素是一種從中藥葛根中提取的異黃酮類化合物，對多種細胞的生長過程具有很好的抑制作用。在低氧環境下，葛根素對缺氧導致的肺動脈平滑肌細胞增殖具有明顯的抑制作用，進而對改善和治療缺氧性肺動脈高壓有良好的效果〔9〕；在血管平滑肌細胞中，葛根素通過上調p27蛋白和下調細胞周期蛋白(cyclin)E表達使G0/G1期細胞數增多，S期細胞數減少，進而抑制血管平滑肌細胞增殖〔10〕。本研究結果發現，葛根素能夠呈濃度-時間依賴性抑制HSC-T6細胞增殖，與郝原青等〔11〕結果相吻合。本研究結果提示，葛根素具有很好的抗肝纖維化作用，其作用機制可能與誘導肝星狀細胞周期阻滯有關。

葛根素具有抗腫瘤、抗氧化和抗感染等多種生理作用，而其抗感染作用正逐漸受到關注和重視；它能夠通過調控炎性因子、免疫細胞和信號通路等多種方式發揮抗感染作用，從而改善癌癥、心血管疾病和糖尿病等炎癥相關疾病的病理過程〔8，12〕。潘亮亮等〔13〕指出，在Lewis肺癌荷瘤小鼠中，葛根素可能通過增加腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2含量和抑制腫瘤組織基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達，抑制小鼠Lewis肺癌原發瘤的生長和轉移。Liu等〔14〕研究發現，在腦缺血/再灌注大鼠模型中，葛根素能夠降低缺血梗死體積，降低腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達，從而改善神經功能。Pan等〔15〕在葛根素減輕糖尿病大鼠腎損傷的機制研究中發現，其作用機制可能與葛根素下調TNF-α和細胞間黏附分子(ICAM)-1的水平有關。同時，胡麗梅等〔16〕還發現，在妊娠糖尿病患者中，葛根素能夠抑制炎癥信號通路TLR4/NF-κB的活化而減少炎性因子的釋放。炎癥反應與肝纖維化的發生發展密切相關〔17〕，肝細胞分泌的各種細胞因子、炎性因子和生長因子等是激活肝星狀細胞的重要機制之一。NF-κB是介導炎癥反應的關鍵調節因子，TGF-β1是最為強效的致纖維化細胞因子，在肝纖維化的發生發展過程中均發揮重要作用。Ji等〔18〕指出，葛根素能夠通過調控NF-κB信號通路抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應。Tao〔19〕發現，葛根素能夠抑制心肌梗死小鼠單核細胞趨化蛋白(MCP)-1的活化，降低心肌組織中TGF-β1的表達，從而減輕小鼠的心肌纖維化。本研究結果提示，葛根素可能通過抑制炎癥相關因子TGF-β1和NF-κB信號通路，緩解肝纖維化過程中的炎癥反應，進而起到抑制HSC-T6細胞生長的作用。

綜上，葛根素能夠抑制肝星狀細胞生長，其作用機制可能與抑制炎癥相關因子TGF-β1和NF-κB信號通路有關。

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