N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷對癲癇模型大鼠行為學、腦電圖及腦內泛連接蛋白-1表達的影響

羅海龍 姜愛英 賈 茜 郭艷芹 畢鵬翔 張忠敏 董 妍

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157000)

癲癇是以神經元過度放電所導致的突然反復發作和暫時性中樞神經系統功能失常為特征的慢性神經系統常見病〔1〕。癲癇發病率與性別和年齡的關系較為密切，一般來講，女性患病率高于男性，1 歲內患病率高，隨著年齡逐漸增高，而患病率呈逐漸下降趨勢，在老年人群患病率較低〔2〕。如長期反復發作或是癲癇持續狀態，可引起患者語言、記憶甚至學習等認知功能障礙及導致海馬和(或)顳葉神經出現異常，但是目前關于癲癇的具體發病機制尚未完全闡明〔3,4〕。研究發現，導致癲癇發作的一個重要原因為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度激活〔5,6〕。NMDA受體阻斷具有明顯的神經元保護作用，并抑制神經元泛連接蛋白(Panx)-1表達〔7〕。本研究旨在研究NMDA受體阻斷對癲癇大鼠行為學、腦電圖及海馬和顳葉Panx-1表達的影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠70只，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供(通過牡丹江醫學院動物實驗倫理委員批準)，實驗動物合格證號為：P00102008，生產許可證號：SCXK(黑)2015-001，使用許可證號：SYXK(黑)2015-007。空調恒溫室內22℃，相對濕度50%，自由飲食，通風換氣20次/h，適應性飼養1 w。

1.2實驗藥物及主要試劑 NMDA受體拮抗劑MK-801(地卓西平，純度>98.0%)購于美國Apexbio公司；Panx-1抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Sigma公司；增強化學發光(ECL)試劑盒(美國Amersham Bioscience公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；二辛可寧酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3主要儀器 動物立體定向儀(ALC-H，北京吉安得爾科技有限公司)；多道生理信號采集處理系統購自(RM6240型，成都儀器廠)；蛋白成像系統(ChemiDoc XRS，美國BIO-RAD公司)；轉膜儀(VE-186，上海天能科技有限公司)；電泳儀(PowerPac HV，美國BIO-RAD公司)。

1.4大鼠癲癇模型復制 SD大鼠60只術前禁食12 h，不禁水。稱重后，腹腔注射10% 水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，仰臥位固定于腦立體定位儀上，剪毛，絡合碘消毒皮膚，沿大鼠頭部正中線作1 cm 的縱向切口，暴露前囟和冠狀縫。以微量注射器于大鼠右側海馬CA3中心區(前囟后3.8 mm，中線旁4.9 mm，顱骨下7.0 mm)處在10 min內緩慢注射海人酸(0.5 μg/μl)2 μl，術后縫合頭皮，肌注青霉素以預防感染〔8〕。正常對照組(n=10)以生理鹽水代替海人酸注射，余操作與以上相同。

1.5模型復制成功標準 癲癇發作癥狀擬采用Racine分級標準：0級：無任何反應；Ⅰ級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等；Ⅱ級：Ⅰ級加節律性點頭；Ⅲ級：Ⅱ級加前肢肌陣攣，但無后肢直立位；Ⅳ級：Ⅲ級加后肢直立位；Ⅴ級：全面性強直-陣攣發作，并失去體位控制〔9〕。達到Ⅳ級為癲癇模型復制成功。制備模型過程中，如果出現大鼠死亡現象，或者Racine分級未達到Ⅳ級，則按照隨機原則補齊大鼠。

1.6分組及給藥 大鼠癲癇模型復制過程中6只死亡，14只因Racine分級未達到Ⅳ級而棄用。剩余符合條件的40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組，每組10只。模型復制成功后，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組腹腔注射相應劑量的MK-801〔10，11〕，正常對照組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，1次/d，連續21 d。

1.7行為學觀察 ①按照Racine分級標準，記錄各級別的發作數量。②給藥過程中記錄治療平均癲癇發作時間，平均癲癇發作時間=發作總時間/發作總次。

1.8腦電圖檢測 RM6240型多道生理信號采集處理系統記錄各組大鼠腦電圖波形，并分析腦電圖波形的頻率及波幅。

1.9取材 行為學觀察及腦電圖檢測后，各組大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬及顳葉，-80℃保存，備用。

1.10蛋白質Western印跡法檢測海馬和顳葉Panx-1表達 嚴格按照試劑盒說明書提取海馬和顳葉總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳完畢后， 濕轉移法轉膜至0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉液〔5% 脫脂奶粉封閉+吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)〕封閉2 h。 然后與Panx-1抗體(1∶500稀釋)4℃孵育過夜，反復吐溫 Tris-緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次，與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h。ECL試劑反應，X線(暗室)曝光，室溫顯影，定影。ChemiDoc XRS蛋白成像系統對各組條帶進行灰度值計值。以GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)為內參。

1.11實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)檢測神經元Panx-1 mRNA的表達 Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度，按照Real Time-PCR試劑盒進行反轉錄反應，合成單鏈的cDNA。cDNA產物保存在-20℃。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物。Real Time-PCR反應體系：體積為20 μl；反應程序為：95℃預變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環，最后72℃ 延伸5 min。每個樣本以內參基因GAPDH調整。2-ΔΔCT法定量分析。引物序列Panx-1：正義TCTGCTCCGACCTGAA，反義GAAGAGCGTGTAGATGACC，168 bp；GAPDH：正義GAGGGAAATCGTGCGTGAC，反義GCATCGGAACCGCTCATT，212 bp。

1.12統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件進行單因素方差分析、LDS、Games-Howell檢驗和秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組Racine分級結果 與正常對照組比較，模型組Racine分級級別顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組Racine分級級別顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組Racine分級結果比較(n,n=10)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；表2同

2.2各組平均癲癇發作時間 與正常對照組比較，模型組平均癲癇發作時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組平均癲癇發作時間顯著縮短(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3各組腦電圖檢測結果 與正常對照組比較，模型組腦電頻率顯著降低，腦電波幅顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組腦電頻率顯著升高，腦電波幅顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4各組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達 與正常對照組比較，模型組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2，圖1。

表2 各組癲癇發作時間、腦電圖檢測及Panx-1蛋白、mRN相對表達量比較

A.正常對照組；B.模型組；C.MK-801 0.5 mg/kg組；D.MK-801 1.0 mg/kg組；E.MK-801 1.5 mg/kg組圖1 各組Panx-1表達Western印跡結果

3 討 論

NMDA 受體主要存在于大腦的神經細胞上，是一種跨膜離子通道型谷氨酸受體，在調節大腦學習和認知功能及可塑性等發面具有十分重要的作用，其功能發生障礙所導致的興奮性神經毒性則與智力障礙、精神分裂癥、自閉癥、癲癇等眾多神經系統疾病相關〔12,13〕。癲癇發生與NMDA受體過度激活有關，其在癲癇發生過程中發揮的作用正受到越來越多的關注〔14,15〕。在全腦幾乎都有NMDA受體分布，分布最多的位置主要包括大腦皮質、紋狀體、杏仁體、顳葉、海馬等〔16〕。NMDA受體是神經元中一種重要的配體依賴的電壓門控的選擇性鈣離子通道，具有電壓依賴性的Mg2+阻斷特性及對鈣離子的高通透性，當NMDA受體過度激活，解除了內源性Mg2+的阻滯作用，過多的神經元的突觸后膜發生同步性去極化，發生持續性放電，最后引起癲癇〔17〕。目前有關于NMDA受體的研究主要集中于藥物對其表達的影響〔18,19〕。關于NMDA受體阻斷對癲癇模型大鼠行為學、腦電圖的影響鮮見報道。本研究提示NMDA受體阻斷對改善癲癇大鼠癲癇行為及腦內神經元異常放電產生積極影響。

Panx-1蛋白是縫隙連接半通道蛋白，其主要功能可能是介導神經細胞之間異常同步放電，與NMDA受體密切相關，可以被NMDA受體激活進而引起癲癇〔20〕。本研究結果提示，NMDA受體阻斷可明顯降低癲癇大鼠海馬和顳葉Panx-1和Panx-1 mRNA表達。

1Ortega-Moreno L，Giráldez BG，Soto-Insuga V，etal.Molecular diagnosis of patients with epilepsy and developmental delay using a customized panel of epilepsy genes〔J〕.PLoS One，2017;12(11)：e0188978.

2毛慧慧，王炳芳.舍曲林聯合丙戊酸鈉對癲癇伴精神障礙老年患者免疫及精神功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2018;38(2)：440-2.

3金漢娜，謝 煒，禤正正，等.柴胡疏肝湯對慢性顳葉癲癇大鼠行為學及NMDA受體亞單位NR2B和CaMKⅡ蛋白表達的影響〔J〕.世界科學技術-中醫藥現代化，2015;17(12)：2577-83.

4馮 云，劉 津，唐海丹，等.枸杞多糖對癲癇大鼠神經的保護作用及機制〔J〕.中國老年學雜志，2017;37(24)：6036-8.

5Schidlitzki A，Twele F，Klee R，etal.A combination of NMDA and AMPA receptor antagonists retards granule cell dispersion and epileptogenesis in a model of acquired epilepsy〔J〕.Sci Rep，2017;7(1)：12191.

6Addis L，Virdee JK，Vidler LR，etal.Epilepsy-associated GRIN2A mutations reduce NMDA receptor trafficking and agonist potency-molecular profiling and functional rescue〔J〕.Sci Rep，2017;7(1)：66.

7羅海龍，賈 茜，姜愛英，等.N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型泛連接蛋白-1表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2017;37(23)：5752-5.

8薛 韜，仝秀清.寧癇顆粒聯合卡馬西平對難治性癲癇模型大鼠炎癥反應的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016;36(20)：4985-6.

9孟陸亮，毋榮榮，史正剛，等.平癇沖劑對幼年海人酸顳葉癲癇模型大鼠學習記憶行為的影響〔J〕.西部中醫藥，2013;26(4)：19-22.

10Sato K,Morimoto K，Okamoto M.Anticonvulsant action of a non-competitive antagonist of NMDA receptors (MK-801)in the kindling model of epilepsy〔J〕.Brain Res，1988;463(1)：12-20.

11Inan SY，Aksu F.Influence of sex on the interaction between dizocilpine (MK-801) pretreatment and acute cold-restraint stress in epilepsy susceptibility in an animal study〔J〕.Gend Med，2008;5(2)：136-46.

12廖 浩，裴文迪，黃 琴.抗NMDA受體抗體在神經精神狼瘡發病機制中的研究進展〔J〕.中國免疫學雜志，2018;34(1)：137-40,143.

13楊展能，姜靚婧，顧仕紅，等.NMDA受體在匹羅卡品癲癇小鼠海馬星形膠質細胞活化中的作用〔J〕.東南大學學報(醫學版)，2017;36(2)：129-36.

14焦 聚，馬 融，任獻青.NMDA受體及其與癲癇所致認知功能損害的關系〔J〕.中國中西醫結合兒科學，2014;6(3)：215-8.

15彭毓棻，宋 治.NMDA受體在癲癇發病機制中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(6)：1230-3,1239.

16夏春鳳，李艷菊，朱 瑾，等.二氮嗪預處理對Aβ(1～42)作用神經元NR2B亞基蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(2)：401-4.

17賈祥磊，張繼川.N-甲基-D-天冬氨酸受體在可卡因成癮中作用的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(21)：6285-8.

18李 艷，景 瑋，馬 彪，等.遠志總皂苷對癲癇模型大鼠NMDA受體表達的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2016;14(13)：1481-3.

19王恒林，米衛東，王卓強，等.丙泊酚對匹魯卡品誘發癲癇持續狀態大鼠海馬NMDA受體2A、2B亞型表達的影響〔J〕.解放軍醫學雜志，2010;35(5)：530-2,536.

20孔祥興，李彬寅，管曉靜，等.Pannexin1的分布及其開放調控〔J〕.生理科學進展，2013;44(3)：188-92.