吡格列酮通過下調(diào)Toll樣受體/核因子-κB信號通路對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

孫 軍 溫昌明 張保朝 聞公靈 周 靜

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473003)

缺血性腦血管病的治療方法主要包括溶栓治療、降纖藥物治療、抗血小板治療、抗凝治療、中藥治療及外科手術(shù)治療等。溶栓治療是指通過血管再通恢復(fù)局部供血，但進(jìn)行再灌注則會(huì)加重缺血組織的進(jìn)一步損傷〔1〕。局灶性腦缺血再灌注損傷中先天性免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)起著重要作用〔2～4〕。Toll樣受體(TLR)4在炎癥反應(yīng)中起重要作用，缺血再灌注中，TLR4/核因子(NF)-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可引起NF-κB轉(zhuǎn)移，NF-κB的活化可進(jìn)一步誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)并加重?fù)p傷，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔5，6〕。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ是一種配體激活型核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族，在體內(nèi)多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑在多種臟器缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中，能減輕其缺血再灌注病理損傷，說明PPARγ具有抑制炎癥反應(yīng)和炎性因子表達(dá)的功能〔8〕。本試驗(yàn)觀察吡格列酮對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對大鼠外周血中IL-6、TNF-α含量及腦組織中TLR4、NF-κB表達(dá)的影響，探討其腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 吡格列酮購于連云港德源藥業(yè)有限責(zé)任公司，TLR4、NF-κB抗體購自英國Abcam公司，鼠抗IL-6、TNF-α單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購于武漢博士德公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G購于中杉金橋，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于美國R&D公司，Trizol Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimerScriptTM RT reagent Kit)、熒光定量試劑(SYBR Green I)購于日本TaKaRa公司。低溫高速離心機(jī)購于北京醫(yī)用離心機(jī)廠，Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀購于芬蘭 Thermo Labsys2tems公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購于瑞士Roche公司。

1.2大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型制備 術(shù)前12 h禁食，自由飲水，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，結(jié)扎CCA和ECA，在ECA結(jié)扎點(diǎn)近端用1 ml注射器針頭刺一小口，將選取好的栓線自左ECA 插入CCA分叉處，固定線栓，剪斷ECA結(jié)扎點(diǎn)近心端。調(diào)整方向，將線栓插入左ICA，輕柔推進(jìn)，長度約為(18±0.5)mm，阻斷大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血。阻斷2 h后，拔出栓線，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅進(jìn)行麻醉和血管分離，不導(dǎo)入栓線。造模后將大鼠放入干凈的飼養(yǎng)籠中，術(shù)中、術(shù)后注意保暖，自由采食和飲水。

1.3動(dòng)物分組及給藥 體重250～300 g的雄性健康SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、生理鹽水干預(yù)組(造模前3 d及術(shù)前1 h灌胃給予生理鹽水2 ml)、吡格列酮治療組〔造模前3 d及術(shù)前1 h灌胃給藥(吡格列酮片15 mg/kg)〕各15只。

1.4神經(jīng)功能缺損評分 觀察并記錄大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀；0分，無神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分，對側(cè)前爪不能完全伸直；2分，行走時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，向病灶對側(cè)跌倒；4分，意識喪失，不能自發(fā)活動(dòng)；5分，死亡。取評分在1～3分者納入研究。

1.5腦梗死體積的測定 每組隨機(jī)取5只大鼠，用水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，置于-20℃冰箱中冷凍。以2 mm間距冠狀切成5片，將大腦切片浸泡在2%氯化三苯基四氮唑(TTC)緩沖液中，放入37℃烘箱中避光孵育30 min。以4%多聚甲醛固定，腦梗死組織為白色，正常腦組織顯示為紅色。相機(jī)拍照采集圖像后用Image J1.37圖像分析軟件，計(jì)算梗死體積百分比(腦梗死體積/對側(cè)腦體積)。

1.6大鼠血清抽取及組織切片制備 4組再灌注24 h后，用水合氯醛麻醉打開胸腔，抽取心臟血2 ml，待常溫凝固1 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，用于ELISA檢測。取血之后，剝離腦組織，先用生理鹽水100 ml沖洗，然后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，用于免疫組化染色。

1.7ELISA測定血清IL-6和TNF-α的濃度 血清IL-6和TNF-α濃度采用雙抗體夾心SABC-ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測定450 nm處測OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中IL-6、TNF-α濃度。

1.8免疫組化技術(shù)檢測腦組織TLR4和NF-κB 蛋白的表達(dá) 大鼠腦組織按照常規(guī)固定、石蠟包埋、切片后，采用SABC法檢測TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作步驟，用3%去離子水過氧化氫孵育10 min清除內(nèi)源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育封閉1 h；分別加入TLR4和NF-κB 鼠單克隆抗體(1∶100)4℃過夜，滴加適當(dāng)比例的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h，滴加SABC復(fù)合物室溫反應(yīng)30 min；DAB顯色，酒精脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測腦組織TLR4和NF-κB mRNA的表達(dá) 取大鼠再灌注24 h后的腦組織，用Trozol法提取組織總RNA，總RNA質(zhì)量用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測；采用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作5倍稀釋用于后續(xù)熒光定量PCR分析。 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的大鼠TLR4、NF-κB 和β-actin的mRNA序列為模板，按照目的片段橫跨兩個(gè)外顯子的原則，用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)。所有引物由大連寶生物工程有限公司合成。RT-PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃×5 min，變性95℃×30 s，退火60℃×30 s，延伸72℃×30 s，均為35個(gè)循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析，即基因表達(dá)差異=2-△△Ct，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物信息

1.10數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分比較 模型組及生理鹽水干預(yù)組均表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，術(shù)后神經(jīng)功能評分〔(2.3±0.69)分、(2.5±0.62)分〕顯著高于假手術(shù)組(0分，P<0.01)，說明造模成功；而吡格列酮治療組神經(jīng)功能損傷癥狀明顯改善，術(shù)后神經(jīng)功能評分〔(1.5±0.73)分〕顯著低于模型組和生理鹽水干預(yù)組(P<0.05)。

2.2各組腦梗死體積比比較 假手術(shù)組腦組織切片經(jīng)TTC染色全部呈紅色，無梗死灶形成；模型組和生理鹽水干預(yù)組腦組織染色可見有明顯的白色梗死灶，主要位于右側(cè)額葉、頂葉皮質(zhì)及紋狀體；吡格列酮治療組腦組織梗死灶體積比〔(14.69±0.94)%〕顯著低于模型組〔(41.65±1.38)%〕和生理鹽水干預(yù)組〔(37.21±2.26)%,P<0.05〕。

2.3各組血中 IL-6和TNF-α濃度比較 與假手術(shù)組相比，模型組和生理鹽水干預(yù)組血清 IL-6和TNF-α含量都顯著升高(P<0.01)；與生理鹽水干預(yù)組、模型組相比，吡格列酮治療組血清IL-6和TNF-α含量都顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α濃度比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與生理鹽水治療組比較：3)P<0.05，下表同

2.4各組腦組織TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較 TLR4、NF-κB 免疫組化陽性表達(dá)呈棕黃色，陽性細(xì)胞染色主要位于胞膜及胞質(zhì)。假手術(shù)組偶見TLR4、NF-κB 免疫陽性細(xì)胞，模型組及生理鹽水干預(yù)組TLR4、NF-κB 免疫陽性細(xì)胞顯著增加(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB 免疫陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，見表3及圖1。

表3 各組腦組織TLR4、NF-κB 免疫陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比較

圖1 各組腦組織TLR4、NF-κB免疫陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)(SABC法，×200)

2.5各組腦組織TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組和生理鹽水干預(yù)組腦組織中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)與模型組和生理鹽水干預(yù)組相比顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)比較

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)有多種藥物如芒果苷〔9〕、葛根素〔10〕、芹菜素〔11〕、熊果酸〔12〕等對腦缺血再灌注損傷都有一定的保護(hù)作用，PPARγ激動(dòng)劑也是在缺血性腦損傷中研究較多的一種藥物。已有大量研究證明，PPARγ激動(dòng)劑WY14643、羅格列酮、吡格列酮等對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可以抑制炎癥反應(yīng)，減少組織損傷等。邱林等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以促進(jìn)缺血再灌注腦組織中PPARγ的表達(dá)水平，降低腦組織炎性因子的水平；李萌等〔14〕認(rèn)為吡格列酮可改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能異常，減輕腦水腫并促進(jìn)損傷腦細(xì)胞的恢復(fù)。本研究結(jié)果說明吡格列酮具有腦保護(hù)作用，這與文獻(xiàn)〔13，14〕報(bào)道的結(jié)果一致。

研究〔15〕表明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、能量代謝紊亂、酸中毒、細(xì)胞凋亡等與缺血再灌注腦損傷的發(fā)生密切相關(guān)，其中研究最多的是炎癥反應(yīng)。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷可能與腦細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)〔16，17〕。TLR4受到刺激后會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子分泌增多，參與缺血性腦損傷中的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。NF-κB參與調(diào)控多種炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子，與腦缺血再灌注損傷有密切關(guān)系，腦缺血時(shí)會(huì)誘發(fā)NF-κB的活化，促使黏附分子、細(xì)胞表面受體、趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)增加，進(jìn)一步加重缺血區(qū)的腦損傷程度。研究證實(shí)TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用〔18〕，劉軍等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，TLR4對缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。余偉軍等〔20〕發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可能通過降低NF-κB活性，抑制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，從而在腦缺血再灌注損傷后，對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。綜上，TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活會(huì)加重腦缺血再灌注的炎癥損傷。

1湯軼波，孔 冉，白 雪，等.腦缺血再灌注損傷的中西醫(yī)治療研究進(jìn)展〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016；14(10)：1100-3.

2Jin AS，Jeong SI，Kim M，etal.Visceral adipose tissue inflammation is associated with age-related brain changes and ischemic brain damage in aged mice〔J〕.Brain Behav Imm，2015；6(50)：221-31.

3Liesz A，Kleinschnitz C.Regulatory T cells in post-stroke immune homeostasis〔J〕.Translational Stroke Res，2016；7(4)：1-9.

4張世應(yīng)，凃 靜.阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及對細(xì)胞炎性蛋白-2和Toll樣受體-4表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(13)：3140-1.

5Tu XK，Yang WZ，Chen JP，etal.Curcumin inhibits TLR2/4-NF-κB signaling pathway and attenuates brain damage in permanent focal cerebral ischemia in rats〔J〕.Inflammation，2014；37(5)：1544-51.

6Zhang Y，Zhang S，Li H，etal.Ameliorative effects of Gualou Guizhi decoction on inflammation in focal cerebral ischemic-reperfusion injury〔J〕.Mol Med Reports，2015；12(1)：988-94.

7Xu J，Zhu Y，Wang G，etal.The PPARγ agonist，rosiglitazone，attenuates airway inflammation and remodeling via heme oxygenase-1 in murine model of asthma〔J〕.Acta Pharmacol Sinica，2015；36(2)：171-8.

8侯春萌，梁貴友.PPARγ及配體在缺血再灌注肺損傷中的作用〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014；52(10)：157-60.

9李 雪.芒果苷對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

10Zhou F,Wang L,Liu P，etal.Puerarin protects brain tissue against cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting the inflammatory response〔J〕.Neural Regeneration Res，2014；9(23)：2074-80.

11Cai M，Ma Y，Zhang W，etal.Apigenin-7-O-β-D-(-6′′-p-coumaroyl)-Glucopyranoside Treatment Elicits Neuroprotective Effect against Experimental Ischemic Stroke〔J〕.Int J Biol Sci，2016；12(1)：42-52.

12陳 鵬，丁志杰.熊果酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015；21(12)：129-33.

13邱 林，蔣 雪，文 玲，等.吡格列酮通過上調(diào)PPARγ降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織炎性細(xì)胞因子的水平〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016；32(2)：182-4.

14李 萌，張 靖，張煥新.PPARγ激活物對缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(7)：1582-4.

15劉 磊，劉麗華，馬玉奎.腦缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.藥學(xué)研究，2016；35(9)：542-4.

16Hu MZ，Zhou B，Mao HY，etal.Exogenous hydrogen sulde postconditioning protects isolated rat hearts from ischemia/reperfusion injury through sirt1/PGC-1α signaling pathway〔J〕.Int Heart J，2016；57(4)：477-82.

17Zhao GL，Yu LM，Gao WL，etal.Berberine protects the heart from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress via the JAK2/STAT3 signaling pathway〔J〕.Acta Pharmacol Sinica，2016；37(3)：354-67.

18Tiecheng L，Jingui Y，Rongying C，etal.Mycophenolate mofetil attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury via regulation of the TLR4/NF-κB signaling pathway.〔J〕.Pharmazie，2014；69(11)：850-5.

19劉 軍，毛善平，董慧敏，等.TLR4參與缺血后處理對缺血再灌注損傷致細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病，2014；21(3)：144-7.

20余偉軍，余 智，盧波達(dá)，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦缺血再灌注損傷大鼠核轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤壞死因子-α和細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國醫(yī)師雜志，2014；16(12)：1645-8.