葡萄籽原花青素對放射性腦損傷大鼠學習能力和生長相關蛋白-43表達的影響

張慧民 肖 穎

(唐山工人醫院，河北 唐山 063000)

放射性腦損傷(RIB)是顱面頸區腫瘤放射治療后的常見并發癥，接受全腦照射并存活患者出現認知功能障礙的概率高達50%～90%，且認知障礙的程度往往與照射的劑量有關〔1〕。葡萄籽原花青素(GSPE)是從葡萄籽中提取出的生物類黃酮物質，具有極強的抗氧化和清除自由基作用〔2〕；GSPE不僅可抑制腫瘤細胞的生長、遷移；同時可減輕輻照引起的臟器損傷〔3～5〕。本研究建立RIB模型，觀察神經元再生突觸重塑的首選分子學標志——內源性再生相關因子生長相關蛋白(GAP)-43的表達變化。

1 材料與方法

1.1動物分組和模型制備 62只雄性SD大鼠隨機分成對照組，模型組，高劑量GSPE組各18只、低劑量GSPE組8只。照射后7、14和28 d為觀察時間點。對照組：動物只進行常規麻醉，不進行照射；模型組：動物常規麻醉，參考文獻〔6〕制作RIB模型,方法：采用德國進口加速器產生的6 MeV電子線對大鼠進行單次全腦照射，源皮距為100 cm，吸收劑量率250 MU/min，吸收劑量為22 Gy；GSPE組：動物照射方法同模型組；在動物進行照射前2 w開始每天灌胃給藥1次,持續給藥至觀察時點，低、高劑量GSPE組分別為100、200 mg/kg。

1.2學習能力評測 采用ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統測定動物行為學能力。將各組大鼠按時間點分別放入穿梭箱，適應5 min消除探究反射后給予鈴聲刺激5 s，繼之給予電擊20 s，間隔10 s后進入下一輪訓練。訓練中，如果在鈴聲刺激5 s內大鼠逃向安全區，則為主動回避反應，系統自動停止當次訓練；如果在鈴聲刺激5 s內大鼠未逃向安全區，則給予1.5 mA交流電20 s，如果在電擊后逃向安全區，則為被動回避反應陽性，否則為主動、被動回避反應陰性。每只大鼠電擊30次，記錄被動回避潛伏期(PAL)、主動回避反應次數等參數。主動回避反應次數占總訓練次數的百分比即為主動回避反應率(AARR)；AARR越高，PAL越短，表明動物學習能力越強。

1.3腦組織皮質區形態結構觀察 各組各時間點取3只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片，片厚5 μm，HE染色。光學顯微鏡下觀察。

1.4免疫組織化學法和RT-PCR法檢測GAP-43表達 免疫組織化學法：取材動物及標本采集與HE染色方法相同，切片常規脫蠟至去離子水，滴加復合消化液后入加入37℃溫箱孵育20 min，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min，入3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶15 min，經PBS洗滌后滴加兔抗鼠GAP-43多克隆抗體(1∶300)，4℃過夜；37℃復溫45 min，PBS洗滌后滴加生物素化二抗，37℃ 40 min，PBS洗滌；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度復染，脫水透明，封片。在有測微尺的光學顯微鏡(20×10)下計數該視野下的陽性細胞數(細胞核中有陽性表達產物，染色呈棕黃色)。RT-PCR法：各組各時間點取3只大鼠,致死后迅速取雙側海馬區組織，稱量0.6 g,加入1 ml RNAiso Plus溶液后勻漿，室溫靜置5 min后12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清移至新的1.5 ml離心管內，加入1/5RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，將上清液轉移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄掉上清液，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清保留沉淀，干燥(不可加熱)，溶解于30 μl DEPC處理水中，測量OD260/280值，根據OD260計算RNA濃度，-80℃保存。檢測步驟：GAP-43引物正義鏈:5'CCCAAGCTTCCATGCTGTGCTGTATGAG3';反義鏈:5'GGGTACCCTCAGGCATGTTCTTGGTC3';上海生工生物技術有限公司合成。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組穿梭實驗結果比較 與對照組相比，模型組AARR明顯減少、PAL明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05),且至照射后28 d時，AARR和PAL恢復跡象不明顯；與模型組相比，GSPE組AARR明顯增多、PAL明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)，且28 d時AARR和PAL恢復跡象明顯，高劑量GSPE效果更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 各組AARR比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組PAL比較

圖1 各組海馬區神經元形態結構變化(HE，× 400)

2.2各組神經細胞形態結構改變 對照組神經細胞形態結構正常,胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。模型組可見神經細胞變性水腫,細胞輪廓模糊;亦可見部分死亡細胞,表現胞體收縮呈多角形或不規則。GSPE組神經細胞形態結構減輕，在高劑量組變化尤為明顯。見圖1。

圖2 各組海馬區GAP-43免疫組化染色結果(DAB，×400)

2.3各組GAP-43免疫組織化學和RT-PCR結果 免疫組織化學GAP-43陽性表達主要位于細胞質，陽性細胞的胞質可見細小的棕黃色顆粒，見圖2。對照組有少量GAP-43陽性細胞，染色棕黃；與對照組比較，模型組7、14 d時間點GAP-43陽性細胞均明顯增多，28 d有所降低，但仍明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GSPE組各時間點GAP-43陽性細胞明顯增多，高表達狀態持續至28 d，在高劑量組變化尤為明顯，差異有統計學意義(P<0.05),見表3。RT-PCR結果顯示：與對照組比較，模型組7、14 d時間點GAP-43 mRNA表達水平明顯增高，28 d有所降低，但仍明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組組比較，GSPE組各時間點GAP-43 mRNA水平進一步增高，高表達狀態持續至28 d，在高劑量組變化尤為明顯，差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表3 各組海馬區GAP-43免疫組織化學陽性細胞數比較個/視野)

表4 各組海馬區GAP-43 mRNA表達水平比較

3 討 論

本研究說明GSPE對RIB學習障礙有較好的防治作用。電離輻射可以造成腦內氧化應激，炎癥反應，進而導致神經元損傷、神經遞質釋放紊亂等，認知能力損傷〔7,8〕。因此應用具有較強抗氧化作用的GSPE〔其抗氧化能力是維生素(Vit)E的50倍、VitC的20倍，與超氧化物歧化酶(SOD)相當〕可以降低RIB造成的認知障礙。此外GSPE具有抑制炎癥通路激活和炎癥反應的作用。近期學者相繼報道了GSPE通過抑制氧化應激和P38MAPK炎癥信號激活而起到睡眠呼吸暫停低氧大鼠空間記憶損傷的改善作用〔9,10〕。

GAP-43是軸突生長因子的代表，腦損傷刺激后，未受損神經細胞大量合成GAP-43，可通過與胞內信息分子G蛋白等相互作用，提高興奮性氨基酸受體的反應性，釋放鈣調素，促使軸突側支出芽和形成，允許神經元軸突繼續延伸，調控神經元細胞骨架的重新裝配、有利于神經通路的整合〔11〕；黃海玲等〔12〕的研究顯示參芎化瘀膠囊可改善全腦缺血大鼠神經功能，與升高腦內GAP43的表達有關。有學者〔13〕證實淫羊藿苷、低氧訓練等方法具有促使腦損傷后神經再生和神經功能恢復的作用，其機制均與上調腦內GAP-43表達有關。冀勝軍等〔14〕建立急性RIB模型，發現神經再生標記物神經元抗核抗體雙陽性細胞至照射后30 d仍處在較低水平；利用神經影像學發現〔15〕接受放射性治療的鼻咽癌患者腦內與神經發生密切相關物質如N-乙酰天門冬氨酸(NAA)和膽堿(Cho)等物質減少，且與放射的劑量有關。上述研究表明RIB認知障礙的形成與神經發生障礙密切相關。本研究顯示GAP-43在GSPE組呈劑量依賴式顯著增高，且高表達狀態時間延長，說明GSPE可提高GAP-43表達水平，促進神經發生，進而對放射性認知損傷起到很好的防治作用。

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