趙海波，徐 翔，丁佳佳，趙恩鋒

解放軍總醫院 婦產科，北京 100853

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，早期無明顯特異性癥狀，70%確診時已屬晚期。雖然腫瘤減滅術+鉑類為基礎的聯合化療可以使多數患者達到臨床緩解，但仍有超過50%患者出現復發，少數患者甚至在化療過程中出現復發[1]。鉑類耐藥是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)復發的主要原因。研究表明只有20%復發患者在隨訪早期發現，絕大多數復發患者發現時已失去最佳治療時機[2]。所以尋找一種能夠早期預測鉑類藥物敏感性的指標是目前EOC治療研究的主要方向。核酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)途徑是修復鉑類藥物導致的DNA損傷的重要機制。切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)是 NER途徑的限速酶[3-6]。早期研究顯示腫瘤組織中ERCC1表達產物(如蛋白質或mRNA)可作為預測鉑類化療療效的生物學指標。但目前研究表明基于腫瘤組織的ERCC1表達產物不能指導臨床預測鉑類藥物敏感性[7-9]。這可能與腫瘤細胞的異質性有關。循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是原發或轉移腫瘤組織脫落入循環系統的腫瘤細胞，能夠實時反映腫瘤細胞在體內情況[10]。本文研究CTC中ERCC1的表達與EOC患者臨床特征、鉑類藥物敏感性的關系。

對象和方法

1 對象 以2015年3月- 2017年6月本院診治的60例EOC患者為研究對象。納入標準：1)病理診斷為EOC；2)已行滿意的腫瘤細胞減滅術(殘留病灶直徑＜1 cm)，術后計劃行6個療程卡鉑/紫杉醇化療(周期為21 d)；3)化療完成后達到完全臨床緩解。排除標準：1)同時合并其他惡性腫瘤；2)化療期間更改化療方案；3)未完成6個療程化療；4)出現嚴重并發癥化療延遲。均經患者本人及家屬簽署知情同意書，研究方案經解放軍總醫院倫理委員會批準。

2 標本收集 所有患者手術后化療前、3個療程化療后1周內分別抽取空腹外周血5 ml至含有EDTA抗凝劑中，抽血部位為肘正中靜脈，為防止穿刺皮膚時皮膚細胞污染，每次都棄去前面的2 ml血。

3 樣本處理 腫瘤細胞富集：將5 ml外周血樣本顛倒混勻，加入15 ml紅細胞裂解液混勻，室溫靜止30 min裂解紅細胞。500×g離心5 min，去除上清液；使用終濃度為4%的甲醛固定剩余細胞沉淀8 min；將固定后的細胞轉移至過濾管中(含濾膜)，使用真空抽濾泵將細胞過濾至濾膜上。過濾后的含細胞的濾膜，使用4%甲醛繼續室溫固定1 h。固定后的含有細胞的濾膜使用PBS洗滌3次，置于24孔板中。加入0.1 mg/ml蛋白酶K進行處理，室溫靜置1 h，增加細胞膜通透性。加入特異性捕獲探針，包括上皮型生物標記探針EpCAM、CK8/18/19、間質型生物標記探針(vimentin、twist、zeb1)、白細胞標記物CD45、ERCC1探針進行雜交，顯微鏡進行自動拍照分析，根據標記紅色熒光信號(上皮型標記物)或綠色熒光信號(間質型標記物)CTC分型(圖1)，標記藍信號點代表白細胞，紫色信號點代表ERCC1的表達(圖2)。通過熒光信號判斷白細胞、CTC以及ERCC1的表達情況。

4 隨訪 通過住院病歷及電話隨訪收集患者的年

圖 1 CTC分型鏡檢圖(×100倍油鏡)A：上皮型CTC(紅)； B：混合型CTC(紅+綠)； C：間質型CTC(綠)Fig. 1 Different types of CTC images by florescence microscopeA：Epithelial CTC (red fluorescence); B：E-M mixed CTC (red and green fluorescence); C：Msenchymal CTC (green fluorescence)

圖 2 CTC中ERCC1表達(紫色)(×100倍油鏡)A：上皮型CTC中ERCC1表達； B：混合型CTC中ERCC1表達； C：間質型CTC中ERCC1表達Fig. 2 ERCC1 expression of CTC (the purple fluorescence for ERCC1 expression)A：ERCC1 expression in epithelial CTC; B：ERCC1 expression in E-M mixed CTC; C：ERCC1 expression in msenchymal CTC

齡、家族史、病理類型、腹水情況、腹水細胞學情況、殘余病灶、FIGO分期等方面資料。鉑類敏感型復發：鉑類藥物化療結束后達到完全臨床緩解后復發，復發時間＞6個月；鉑類耐藥型復發：鉑類藥物化療結束后達到完全臨床緩解后復發，復發時間＜6個月。根據化療前后ERCC1 + CTC數目變化將ERCC1 + CTC患者分為化療后ERCC1 +CTC數目升高組(ERCC1 + CTC-H組)和ERCC1 +CTC數目未升高組(ERCC1 + CTC-L組)。隨訪截止時間為2018年1月1日，因隨訪時間短未完成全部患者無進展生存期及總生存期隨訪。

5 統計學方法 數據分析應用SPSS24.0軟件進行處理，計數資料采用率表示，兩組間比較采用Fishers精確檢驗；計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ERCC1 + CTC檢出率 60例中83.3%(50例)檢測出CTC，60%(36例)檢測出ERCC1 + CTC。36例ERCC1 + CTC陽性中，檢出率最高為混合型CTC 32例(86.11%)，上皮型及間質型分別28例(77.78%)、26 例 (72.22%)。

表1 兩組患者的臨床特征分析Tab. 1 General clinical characteristics of two groups

2 ERCC1 + CTC患者臨床特征 36例檢測出ERCC +CTC患者中，漿液性癌28例(77.78%)，FIGO分期Ⅲ期、Ⅳ期26例(72.22%)。ERCC1 + CTC-L組24例 (66.67%)，ERCC1 + CTC-H 組 12例 (33.33%)。兩組年齡、家族史、病理類型、腹水情況、腹水細胞學情況、殘余病灶、FIGO分期等均無統計學差異(P＞0.05)。ERCC1 + CTC-L組中62.5%(15例)鉑類藥物敏感，ERCC1 + CTC-H組中16.7%(2例)鉑類藥物敏感，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

討 論

目前多項臨床研究已經證明CTC是導致腫瘤轉移和復發的主要原因，其在腫瘤療效評估方面有廣泛的應用[11-16]。目前研究表明ERCC1在鉑類耐藥中起關鍵作用[17-18]。因此EOC患者外周血CTC中ERCC1表達可作為預測鉑類藥物敏感性的一個指標。

本研究入組60例患者，CTC表達ERCC1患者36例(60%)，根據化療前后ERCC1 + CTC數目變化分為ERCC1 + CTC-H組和ERCC1 + CTC-L組，結果顯示，兩組年齡、家族史、病理類型、腹水情況、腹水細胞學情況、殘余病灶、FIGO分期等均無統計學差異(P＞0.05)，鉑類藥物敏感性差異有統計學意義(P＜0.05)，提示ERCC1表達量增加提高了腫瘤組織DNA損傷修復能力，臨床上表現為對鉑類藥物的耐藥性增強。Du等[19]體外研究發現，慢病毒介導的RNAi沉默ERCC1基因能逆轉耐藥性EOC細胞SKOV3/DDP對順鉑的耐藥性，提示ERCC1表達量下降可增強鉑類藥物敏感性，與本研究的結果一致。

本研究采用納米濾膜結合RNA原位雜交技術，CTC檢出率為83.3%(50/60)，ERCC1 + CTC檢出率為60%(36/60)。Kuhlmann等[1]對143例EOC患者進行研究，14% CTC被檢出，8% ERCC1 + CTC被檢出。Kuhlmann等利用免疫磁性分離技術富集CTC，其原理是利用特異性抗體(EpCAM/MUC/mucin1)與CTC表面特異性抗體結合，將CTC直接分離出來。造成其CTC檢出率低的可能原因：1)這種分離方法主要依賴CTC表面抗原表達，不表達或低表達目標抗原的CTC將會被漏篩。恰恰其所使用抗體均為上皮細胞抗體，無法篩選間質型CTC；2)在磁場中會發生細胞聚集且與磁柱結合的CTC不易洗脫；3)在磁場中聚集的細胞活性和形態受到影響[20]。由于循環腫瘤細胞的檢出率低，使得ERCC1 + CTC檢出率也下降。本研究采用納米濾膜結合RNA原位雜交技術，利用腫瘤細胞直徑較一般體細胞大的特點，有效避免了由于部分抗原缺失及磁場因素導致的CTC漏篩。此技術可將CTC進一步分為上皮型、混合型、間質型，并可根據熒光強度對ERCC1表達量進行分級。CTC分型及ERCC1表達分類有助于對ERCC1 + CTC進一步深入研究。

綜上所述，ERCC1 + CTC在EOC患者中有較高的檢出率，其在EOC患者治療過程中的動態變化與化療療效有一定的關系，有可能作為預測鉑類藥物敏感性的有效指標，指導EOC患者的個體化治療，提高EOC治療療效。但由于本研究隨訪時間短，樣本例數少，未能完成無進展生存期及總生存期的統計，需進一步擴大樣本量并延長隨訪時間，進一步研究ERCC1 + CTC與EOC預后的關系。

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