白酒酒醅纖維素降解菌的多樣性分析及其分離篩選

劉茂柯，唐玉明，熊洪，劉穎，蔣鵬，任道群，田新惠，姚萬春

1(四川省農業科學院 水稻高粱研究所，四川 德陽，618000) 2(四川省瀘州市釀酒科學研究所，四川 瀘州，646100)

纖維素是植物光合作用的產物，細胞壁的重要成分，也是地球上最豐富的可再生性能源之一[1]。纖維素分子是以吡喃葡萄糖苷為單元，由β-1,4-糖苷鍵連接形成的直鏈多糖，通過氫鍵締合形成纖維束[2]。由于分子結構穩定，自然狀態難被降解，導致目前大量纖維素資源未得到充分利用[3]。

利用纖維素酶將纖維素降解成可發酵性糖是利用纖維素資源的有效途徑[1]。纖維素酶是能將纖維素水解成葡萄糖和纖維二糖的一組酶系的總稱[2]，由于其主要由纖維素降解菌在誘導物的作用下產生，選育高效的纖維素降解菌成為了有效利用纖維素資源的關鍵[1]。雖然已有研究選育的許多菌株顯示出良好的應用效果[4-7]，但總體上，我國纖維素酶工業仍處于初級開發階段，受酶催化率低、生產成本高和周期長等問題的影響，纖維素酶的制備遠無法滿足工業發展的需要[2]。因此，進一步發掘高活力的纖維素降解菌尤為必要。

白酒釀造環境具有豐富的微生物資源，是選育高效發酵菌株的天然寶庫[8-10]。近年研究表明，纖維素降解菌是參與白酒釀造的優勢菌群[11-13]。酒醅是釀酒原料經微生物發酵的產物，也是白酒發酵物質能量代謝活動最活躍的反應中心[9]。理論上，以酒醅為研究材料更有利于分離高活力的功能菌株。因此，本研究探討白酒酒醅纖維素降解細菌的群落多樣性，從中篩選高效菌株，旨在為纖維素資源的有效利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

酒醅樣本于2017年采自瀘州市某知名白酒企業。濃香和清香型酒醅樣品分別采自4和3個酒醅堆。采樣方法是以酒醅堆中心為采樣點，取距表層40 cm處酒醅 (50 g)，于 -80 ℃ 保存。

1.2 主要試劑和儀器

化學試劑 (分析純)、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR引物：生工生物工程 (上海)股份有限公司；EZNATM總DNA抽提試劑盒：美國Omega公司；PCR儀S1000、DGGE儀DCode Universal Mutation Detection System：美國Bio-Rad公司；PCR試劑、pGEM-T載體、EscherichiacoliJM109：寶生物工程 (大連) 有限公司；分光光度計UV2550：日本Shimadzu公司。

1.3 培養基

羧甲基纖維素鈉培養基 (CMC-Na培養基)[14]、剛果紅培養基[15]、酶活培養基[15]、濾紙液體培養基[14]、LB培養基和秸稈液體培養基。秸稈液體培養基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨 2.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，酵母膏2 g，蒸餾水1 000 mL，添加10 g水稻秸稈或10 g 小麥秸稈。秸稈的制備: 80 ℃烘干至恒重，并剪切成 0.5 cm×1 cm的片狀。LB 培養基：酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH 7.0。所有培養基121 ℃ 滅菌15 min備用。

1.4 方法

1.4.1 富集培養

將10 g酒醅樣品置于90 mL CMC-Na液體培養基，28 ℃、200 r/min振蕩培養72 h后取菌液2 mL接種于100 mL CMC-Na液體培養基，按上述培養條件傳代。將第3次傳代的富集培養物用于DGGE分析和菌株分離。

1.4.2 酒醅樣品和富集培養物細菌群落結構的DGGE分析

取3 mL 1.4.1的富集培養物于5 mL離心管，8 000 r /min離心去除上清取沉淀物。采用EZNATM總DNA抽提試劑盒分別提取沉淀物和初始酒醅樣品的細菌DNA。采用引物338F-GC和518R[16]擴增 16S rRNA V3區。PCR反應體系 (50 μL) 和擴增程序分別參照LIU等[10]和FERROCINO等[17]的報道設置。PCR產物的DGGE電泳條件：聚丙烯酰胺凝膠濃度8%，變性范圍30%～60% (100%變性劑含7 mol/L尿素，40%去離子甲酰胺)；使用1×TAE緩沖液，100 V電泳10 min進膠，200 V、60 ℃ 條件下電泳4 h，銀染法染色。將 DGGE優勢條帶回收并用20 μL無菌水浸泡過夜。以浸液為模板，采用引物338F和518R進行PCR擴增后按文獻[18]的方法克隆，由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序所得序列在美國生物技術研究中心 (National Center for Biotechnology, NCBI) 網站進行BLAST比對。用 Quantity One軟件對 DGGE 圖譜進行數字化和標準化處理后，進行UPGMA聚類分析，計算多樣性指數 (H)[19]。

1.4.3 菌株的篩選與鑒定

取1.4.1中的富集培養物1 mL用無菌水梯度稀釋10-4～10-7。將稀釋液涂布于CMC-Na固體培養基，28 ℃ 恒溫培養72 h，挑單菌落于LB固體培養基劃線純化并保種。參照李靜等[20]的方法，將純化菌株涂布于LB固體培養基制成5 mm菌餅，接種到剛果紅固體培養基，28 ℃ 培養4 d，觀察接菌處是否產生透明圈，根據透明圈直徑大小初步判斷菌株產纖維素酶的能力，選取透明圈直徑較大的菌株繼續研究。利用試劑盒提取菌株DNA，采用引物8-27F和1523-1504R進行PCR擴增[21]并測序。將測序獲得的序列通過 BLAST比對獲取相似度較高的模式菌株序列，用 MEGA 4.0中 Neighbor-Joining 法構建系統發育樹[22]。

1.4.4 羧甲基纖維素酶 (CMCase) 活力的測定

1.4.4.1 葡萄糖標準曲線

利用 3, 5-二硝基水楊酸 (DNS) 比色法繪制葡萄糖標準曲線[15]。

1.4.4.2 粗酶液的制備

挑單菌落接種到50 mL酶活培養基，28 ℃、200 r/min振蕩培養，于2、3、4、5、6 d分別取發酵液，6 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清即為粗酶液。

1.4.4.3 酶活測定

取0.1 mL粗酶液置于1.9 mL 10 g/L的CMC-Na溶液中，50 ℃恒溫水解30 min，再加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴反應10 min后冷卻至室溫，定容至25 mL，540 nm處比色，測定OD值，根據葡萄糖標準曲線計算酶活。酶活定義：50 ℃條件下, 1 mL酶液每分鐘催化底物生成1 μg葡萄糖的酶量，稱為1個酶活單位，以U/mL表示[15]。

1.4.5 濾紙條崩解實驗

將CMCase活性較高的菌株制成菌懸液，接種10 mL于90 mL濾紙液體培養基， 28 ℃、120 r/min振蕩培養，定期觀察濾紙條被降解的情況。

1.4.6 秸稈降解率的測定

取5 mL菌懸液 (復合菌系各菌懸液按1∶1的體積比共接種5 mL) (無菌水作對照) 分別接至45 mL秸稈液體培養基，28 ℃振蕩培養7 d。將培養物5 000 r/min離心10 min，棄上清，用蒸餾水反復清洗3次(每次清洗后5 000 r/min離心10 min，棄上清)，80 ℃ 烘至恒重，用差重法計算秸稈降解率。每個處理設置3個重復。

(1)

1.5 數據分析

采用SPSS 13.0進行獨立樣本T檢驗和單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 酒醅樣品及其富集培養物細菌群落結構的DGGE分析

圖1為酒醅樣品及其富集培養物的細菌DGGE圖譜。T檢驗結果顯示，酒醅樣品及其富集培養物細菌H值無顯著差異 (p>0.05)，濃香型酒醅樣品與其富集培養物H值分別為2.99±0.27和3.06±0.29；清香型酒醅為2.83±0.37和3.08±0.91。

圖1 酒醅樣品(A)和富集培養物(B)細菌群落的DGGE圖譜
Fig.1 DGGE profile of bacterial community from original Zaopei samples (A) and enrichment culture (B)
注: 字母N和Q表示濃香和清香型酒醅樣品；B1～B14為測序條帶編號

聚類分析結果 (圖2) 顯示, 同一酒醅樣品與其富集培養物的細菌群落結構相似性較低，相似性系數為0.41～0.64，說明富集培養使酒醅樣品菌群結構發生了顯著變化。對富集培養物DGGE圖譜的優勢條帶進行測序 (B1～B14，圖1B)，所獲序列與NCBI 最似序列同源性為 90.9%～100%，分類于Acinetobacter、Klebsiella、Lactococcus、Paenibacillus、Bacillus(表1)。

圖2 DGGE 圖譜的UPGMA聚類分析
Fig.2 UPGMA dendrogram generated based on the DGGE profiles
注：標尺數值代表樣品間的相似性系數，0表示完全不同，1表示完全相似經16S rRNA基因鑒定，菌株SAAS1～SAAS6與最似模式菌株的同源性97.4%～98.9%，分類于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter(圖4)。

2.2 菌株篩選與鑒定

從富集培養物共篩選到18株能在剛果紅培養基形成透明圈的細菌，選擇透明圈直徑較大的6株細菌(命名為SAAS1～SAAS6)進行后續試驗(表2和圖3)。

表1 DGGE圖譜條帶序列的BLAST分析Table 1 BLAST results of selected bands from the DGGE profile

圖3 菌株SAAS1～SAAS6在剛果紅培養基上形成的透明圈
Fig.3 Transparent circle on cellulose congo red agar plates for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

圖4 菌株SAAS1～SAAS6 的16S rRNA系統進化樹
Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6
(注：本實驗所得序列用粗體表示，Methanosaeta concilii NBRC 103675T(AB679168) 為外群序列。)

2.3 CMCase活力測定

以540 nm處吸光OD值為縱坐標，葡萄糖質量(mg)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程為y=0.402x+0.004,R2=0.995。經測定，各菌株的最高CMCase活力及到達最高酶活的時間不同 (表2)。菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的酶活較高，分別為92.04、84.85和103.10 U/mL；SAAS2 (66.34 U/mL)和SAAS6 (59.98 U/mL) 次之，SAAS4酶活較低，僅23.77 U/mL。以上3個水平的差異顯著 (p<0.05)。此外， SAAS2、SAAS3和SAAS6達最高酶活的時間為4 d，SAAS1和SAAS5為5 d，SAAS4為3 d。

2.4 菌株對濾紙條的崩解效果

對菌株SAAS1～SAAS6進行濾紙裂解能力測試。結果顯示，6株菌對濾紙條均具有一定的裂解能力 (表2)。菌株SAAS3和SAAS5的降解能力最強，濾紙潰爛成糊狀 (圖5)；SAAS1將濾紙裂解為長度較短的片段；其余3株細菌 (SAAS2、 SAAS4、SAAS6) 對濾紙條降解作用小，僅在濾紙邊緣出現毛邊。因此，取 SAAS1、SAAS3和SAAS5 進行秸稈降解率測定。

2.5 秸稈降解率測定

由圖6和圖7可知，菌株SAAS1、SAAS3、SAAS5對水稻秸稈和小麥秸稈均具有降解作用。此3株菌對水稻秸稈降解率分別為22.77%、7.15%、6.93%；對小麥秸稈的降解率分別為6.88%、5.56%、8.55%。按隨機組合方式，將以上3菌株構建4個復合菌劑并測試其秸稈降解率。結果表明，復合菌劑SAAS1+SAAS3和SAAS1+SAAS3+SAAS5對2種秸稈的降解率較單一菌株均有顯著提高 (p<0.05)。其中，SAAS1+SAAS3+SAAS5組合的降解效果最佳，對水稻秸稈和小麥秸稈的降解率分別達35.32% 和28.89%。

表2 菌株SAAS1～SAAS6的纖維素降解能力評價Table 2 Estimation of the cellulose degradation activity of isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

注：透明圈直徑和CMC最高酶活的實測值為3份樣品重復試驗數據的平均值±標準差；“+”表示濾紙軟化，出現毛邊； “++”表示濾紙條斷裂； “+++”表示濾紙成糊狀。

圖5 菌株SAAS1、SAAA3和SAAS5的濾紙條崩解效果(CK表示對照組)
Fig.5 Filter paper degradation by isolates SAAS 1, 3 and 5 (CK is the control for this experimental set up)

1-SAAS1; 2-SAAS3; 3-SAAS5; 4-SAAS3+SAAS5; 5-SAAS1+SAAS3; 6-SAAS1+SAAS5; 7-SAAS1+SAAS3+SAAS5
圖6 不同菌株處理對水稻秸稈 (A) 和小麥秸稈 (B) 的降解率
Fig.6 Degradation rate of rice(A) and wheat(B) straw by different isolates
(實測值為3份樣品重復試驗數據的平均值±標準差，不同字母表示處理間存在顯著差異,p<0.05)

a-CK; b-SAAS1; c-SAAS3; d-SAAS5; e-SAAS1+SAAS3; f-SAAS1+SAAS3+SAAS5
圖7 不同菌株處理對水稻秸稈 (A) 和小麥秸稈 (B) 的降解效果
Fig.7 Rice(A) and wheat(B) straw degradation by different isolates

3 討論

環境樣品的微生物數量龐大且種類繁多，采用選擇性培養基富集目標菌群有利于提高菌株分離效率。研究證實，利用CMC-Na作唯一碳源是富集篩選纖維素降解菌的有效手段[14-15]。以往研究利用CMC-Na培養基富集不同環境樣品的纖維素降解菌[23-24]，發現富集培養物與原始樣品間的菌群結構(DGGE圖譜) 存在顯著差異。這與本研究結果一致，表明富集培養取得了顯著效果。通過富集泥炭沼澤土的纖維素降解菌，袁楠等[24]發現富集培養物的細菌H值顯著下降。但本研究發現富集培養對酒醅細菌H值無顯著影響，說明富集前后樣品的細菌多樣性水平一致。這可能是在富集培養過程中，酒醅纖維素降解菌的生長與被淘汰菌群的衰亡水平相近所造成。另一可能的解釋是，因為消亡菌體的DNA可在環境中保存較長時間不被降解[25]，DGGE揭示的物種可能并非全是纖維素降解菌，從而導致物種多樣性水平的測試值高于真實值。為避免此現象的發生，本研究對酒醅細菌進行3次傳代，目的是在富集纖維素降解菌的同時，降低消亡菌體DNA的優勢度。由于DGGE圖譜僅反映環境樣品的優勢物種[26]，對富集培養物DGGE的優勢條帶測序可較真實的反映纖維素降解菌的物種多樣性。除Lactococcus外，Bacillus、Paenibacillus、Klebsiella和Acinetobacter均被研究證實為高產纖維素酶的種群[12-13, 20, 27]，表明DGGE結果的準確性。另一方面，本研究分離的Novosphingobium和Gluconobacter未被DGGE檢測到。這可能是DGGE條帶未被全部測序造成。事實上，方法學差異常導致研究結果出現偏差[10]，對環境樣品物種多樣性的檢測應結合不同手段方能更真實地反映群落信息。

關于白酒釀造環境纖維素降解菌的分離，以往研究從黃水分離的細菌均以Bacillus為主[12-13]。本研究所得菌株則分類于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter。此結果揭示釀造環境蘊藏豐富的纖維素降解菌值得發掘。產酶水平方面，曾林等[12]選育的B.endophyticusCMCase活力最高，達到153.36 U/mL，具有良好的應用前景。但CMCase活力測定是以人工合成的可溶性纖維素為底物，比天然纖維素更易被細菌分解利用。因此，僅憑CMCase活力水平難以真實反映菌株對天然纖維素的利用能力[12]。如在本研究中，菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的CMC酶活水平相當，但SAAS1對分子結構更接近天然纖維素的濾紙[28]的降解能力較低。所以，進一步評價菌株對天然秸稈的利用能力必不可少。

本研究供試的3株細菌 (SAAS1、SAAS3和SAAS5) 在液態發酵條件下對水稻秸稈和小麥秸稈具有較好的降解效果，但同一菌株對不同秸稈的降解能力存在差異，如菌株SAAS1 對水稻秸稈降解率達22.77%，但對小麥秸稈的降解率僅為6.88%。 此外，SAAS1對濾紙的降解能力雖低于SAAS3和SAAS5，但其對水稻秸稈的降解能力顯著較高 (p<0.05)。以上現象的發生可能與菌株在利用不同碳源時所表達的纖維素酶不同，導致降解效率不同有關[15]。天然纖維素的降解常依賴多種酶的協同作用，利用不同特性的菌株構建復合菌系是提高秸稈降解率的有效手段[14, 29]。本研究通過構建復合菌系混合發酵，顯著提高了菌株對秸稈的降解效果 (p<0.05)，得到的復合菌系SAAS1+SAAS3+SAAS5對水稻秸稈和小麥秸稈液態發酵7 d 的降解率分別達35.32%和28.89%。長期以來，國內外復合菌系研究面臨相同的難點，即在混合菌系中，微生物群落結構及相互作用易受環境因素影響，從而導致菌系功效不穩定[30]。本研究構建的復合菌系由3株細菌組成，菌種少，利于質量控制。今后我們將針對菌株的協同機理及其配伍比例進行研究，進一步加強菌系功效，提高其生產轉化能力。

4 結論

我國白酒釀造環境極為特殊，蘊藏豐富的微生物資源。為充分發揮我國白酒釀造環境的資源優勢，拓展纖維素酶的種質來源，本實驗結合基于分子生物學研究手段的免培養技術(DGGE)和分離培養手段解析酒醅纖維素降解菌的多樣性，選育出3株具有應用潛力的纖維素降解菌，為今后構建高效穩定的復合菌系及纖維素酶的工業生產提供了新的種質資源。