鰱魚重組Cystatin及其酶解產物對草魚冷藏肉片優勢腐敗菌的抑制作用

楊娟，鐘海霞，李樹紅，白稚子，林靈，李美良，劉明宇，林昊

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors，CPIs)，又稱巰基蛋白酶抑制劑，英文簡稱Cystatins，是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸殘基(CySH)的蛋白酶水解作用的可逆抑制因子[1]。許多學者已從動植物的組織和體液中分離到Cystatins蛋白，并形成了非常龐大的Cystatins超家族。Cystatins超家族根據結構特征主要分為Stefin(家族I)、Cystatin(家族II)和Kininogen(家族III)3個家族。CPIs在生物防預[2]、免疫應答與調節[3-4]、癌癥抑制[5]、細胞凋亡[6]、腫瘤侵襲與轉移[7]以及抑菌[8-10]等生理和病理的過程中發揮著重要的作用。

目前對于陸生哺乳動物來源的Cystatin(家族II)研究得比較透徹，但魚類來源的Cystatin(家族II)很可能具有某些特殊的性質或活性。目前僅從部分魚組織中純化出分子質量在12～14 ku的Cystatin，經鑒定均存在Cystatin的保守活性位點[11-12]或典型抑制活性特征[13-14]。此外，盡管部分魚源Cystatin已得到克隆[15]或表達[16-17]，但研究人員尚未對其生物學活性進行深入系統的研究。

關于Cystatin(家族II)的抑菌作用已有報道，某些陸生動物及植物來源的Cystatin(家族II)均對不同種類的細菌[10, 18]或真菌[19-20]表現出明顯的抑制活性，但是關于魚類Cystatin(家族II)的抑菌作用鮮有報道，僅報道鯉魚(Cyprinuscarpio)和香魚(Plecoglossusaltivelis)的受精卵膜提取物(其中含有Cystatin抑制活性)對病原菌表現出抑制作用[21]。此外，本團隊陳海[22]等人通過濾紙片法，證明鰱魚重組Cystatin(家族II)能抑制銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC27853)的生長。但該蛋白對其他常見肉類致腐微生物的抑菌活性仍有待進一步開展。有研究表明，動物來源的Cystatin肽鏈結構的內部，可能存在抑菌序列[23-25]。魚類Cystatin(家族II)肽鏈內部是否存在類似機制，尚未見報道。

為此，本實驗擬通過分析鰱魚重組Cystatin(家族II)的Papain酶解物，對草魚冷藏肉片中分離的3種優勢腐敗菌的抑菌效果，同時結合電泳、液相、質譜等分離鑒定方法，以期對Cystatin內部可能含有的有效抑菌片段進行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚重組Cystatin蛋白凍干粉，參照陳海等[22]的方法由本實驗室制備，純度90.27%，比活性4 130.58 units/mg，分子質量約為20.9 ku。

木瓜蛋白酶(Papain，P4762，10 U/mg)，美國Sigma公司，參照鐘海霞[26]的方法，Papain的純度為95.23%，比活性1.28×105units/(g·min)。

草魚冷藏肉片優勢腐敗菌種：草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)，參考鐘海霞[26]的方法分離篩選。

藍葡聚糖-2000、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe、細胞色素、乳鏈菌肽、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、γ-球蛋白，美國Sigma公司；凝膠制備試劑盒，博士德生物(武漢)有限公司；低分子質量蛋白標準品(4.6～45 ku，9.5～66 ku)，美國BBI公司；IPG預制膠條pH 3～10,美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

LC-2010HT高效液相色譜系統，日本島津公司；SW-CJ1F無菌操作臺，佳寶進化工程設備(蘇州)有限公司；LRH-250生化培養箱，一恒科學儀器(上海)有限公司；JY-ECP3000電泳儀，六一(北京)儀器廠；Mini PROTEIN 3垂直電泳槽、PROTEAN i12等電聚焦系統，美國Bio-Rad公司；Orbitrap Fusion Mass Spectrometer質譜分析儀，美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 Papain酶解鰱魚重組Cystatin

Cystatin與Papain按1∶0.25質量比均勻混合，加入到酶解反應管中，并標記為Cystatin與Papain反應0、6、12、18、24 h的反應管，其中0 h反應管以水代替Papain，而對照管加入相對應體積的Cystatin溶液，并用Cystatin代替所有對照管Papain溶液，之后加入超純水使整個反應體系為1mL。混合后37 ℃水浴。取50 μL各時間點反應混合物，加熱滅酶，留作小肽電泳檢測，剩余的混合液微濾除菌后用作濾紙片檢測。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE檢測Papain酶解程度

將Papain酶解后取樣,通過小肽電泳鑒定其酶解程度。同時與Papain和蛋白原樣進行對比，采用Tris-Tricine電泳系統[27]，參考SCHGGER等人[28-29]的方法制備電泳膠，利用連續Tricine-SDS-PAGE測定目的蛋白分子質量。根據電泳圖確定Cystatin完成酶解所需的時間。

1.3.3 鰱魚重組Cystatin及其酶解物的抑菌效果比較

采用濾紙片法[30]鑒定Cystatin酶解各時間點的酶解物的抑菌效果，以確定酶解的最佳時間。將草莓假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和中間氣單胞菌菌株分別接種于LB液體培養基中培養，當OD600 nm≈0.6時吸取100 μL菌懸液均勻涂布于直徑為60 mm的已加入培養基的平板表面，貼上直徑為6 mm的無菌濾紙，向每片濾紙片上添加15、20、25、30 μL的Cystatin/Cystatin酶解物；同時以無菌水/Papain為對照。將平板于30 ℃恒溫培養16～18 h，觀察測定抑菌圈的大小以判斷鰱魚重組Cystatin的抑菌效果。

1.3.4 凝膠過濾高效液相色譜(TSK-GEL G2000SWXLHPLC)鑒定

參考劉玲[5]的方法鑒定待測樣品的純度和分子質量。以標品藍葡聚糖-2000測定TSK-GEL G2000SWXL的空體積V0，分別以Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(0.573 ku)、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(1.046 ku)、乳鏈菌肽(3.35 ku)、細胞色素C(13.0 ku)、胰蛋白酶(23.3 ku)、胃蛋白酶原(43.0 ku)、牛血清白蛋白(66.0 ku)、γ-球蛋白(150.0 ku)標準蛋白作為標品，相同條件下進行色譜分析，求得各標品的洗脫體積Ve。以Ve/V0值作為縱坐標，標準蛋白分子質量對數為橫坐標，繪制TSK-GEL G2000SWXLHPLC的標準曲線，得到回歸方程為:y=-0.426 9x+3.399 1，R2=0.977 1。

其中色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.80 mm，5 μm)，流動相洗脫液為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L Na2SO4和7.69 mmol/L NaN3)，流速為0.5 mL/min，進樣量100 μm，檢測波長280 nm。

1.3.5 雙向電泳鑒定目的抑菌片段的分子質量和等電點

雙向電泳分為第一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE電泳2個部分，具體操作步驟參考王任[31]的方法，以測定目的抑菌片段的分子質量和等電點。

1.3.6 RPLC-MS/MS串聯質譜分析

參考劉玲[5]的方法鑒定目的抑菌片段的抑菌序列。將目的蛋白樣品進行酶解，凍干之后的肽段用含5%ACN和0.1%FA的溶液充分溶解，離心(17 000g，15 min)后，取上清以3 μL/min流速自動進樣通過Eksigent 1D plus高效液相色譜系統，進入C18捕捉柱，調至流速為300 μL/min洗脫至C18分析柱(100 mm×75 μm，柱料1.9 μm)。用30%A液(95%ACN和0.1%FA)洗脫20 min后線性梯度洗脫5 min至80%B液，并在80%B液處保持5 min的洗脫。洗脫的肽段通過納升電噴霧離子化進入串聯質譜TripleTOF 5600(Applied Biosystem，USA)中。MS掃描范圍(m/z)350～1 250，累積時間0.25 s，MS/MS掃描范圍(m/z)100～1 500，掃描模式：HS高靈敏度模式，累積時間0.05 s，IDA采集模式，1個MS1圖譜選擇20個最強離子進行串級掃描。

1.3.7 數據分析

采用SPSS 22.0數學軟件進行統計分析，Excel 2010計算各指標的平均值和標準差，采用One-Way ANOVA法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE鑒定酶解物

鑒定結果如圖1所示。Cystatin與Papain于37 ℃反應0、6、12、18、24 h時，Papain都能將Cystatin徹底水解成分子質量不同的肽段。但明確該最適酶解時間還需要結合濾紙片實驗，進一步鑒定各時段酶解物的抑菌效果。

M-Marker標準蛋白(9.5～66.0 ku); 1-Papain;2-Papain酶解鰱魚Cystatin 0 h；3-Papain酶解鰱魚Cystatin 6 h;4-Papain酶解鰱魚Cystatin 12 h; 5-Papain酶解鰱魚Cystatin 18 h;6-Papain酶解鰱魚 Cystatin 24 h
圖1 Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定酶解產物
Fig.1 The product was identified by Tricine-SDS-PAGE

2.2 濾紙片法鑒定Cystatin及其酶解產物的抑菌效果

采用濾紙片法鑒定Cystatin酶解各時間點的酶解物對3種優勢腐敗菌(草莓假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和中間氣單胞菌)的抑制效果如表1所示。結果表明，Cystatin酶解0、6、12 h的酶解物對其均有抑菌效果，而Cystatin酶解18 h和24 h后的酶解物沒有抑菌活性。綜上實驗結果表明，Cystatin及其酶解物對3種優勢腐敗菌的抑菌圈直徑大小呈現出Cystatin 6 h酶解物>Cystatin 12 h酶解物>Cystatin原樣。結合Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定結果，可以確定Papain酶解Cystatin的最適條件為：Cystatin與Papain按m(Cystatin)∶m(Papain)=1∶0.25，均勻混合，37 ℃下反應6 h，其對優勢腐敗菌的抑制作用見圖2。

表1 Cystatin不同酶解時間酶解物對腐敗菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of cystatin enzyme of differenttime dominant spoilage strains

注：“—”表示沒有出現抑菌圈。

a-草莓假單胞菌; b-腐敗希瓦氏菌; c-中間氣單胞菌;
A-Papain對照; B-Cystatin 15 μL/片; C-Cystatin 20 μL/片; D-Cystatin 25 μL/片; E-Cystatin 30 μL/片
圖2 Cystatin 6 h酶解物對優勢腐敗菌的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effect of cystatin 6 h enzyme on dominant spoilage strains

實驗中酶解后的Cystatin較Cystatin原樣對3種優勢腐敗菌的抑菌效果強，可能是由于Cystatin酶解后其內部的抑菌序列暴露出來，增強了抑菌效果。Cystatin酶解6 h的酶解物較Cystatin酶解12 h對3種腐敗菌的抑菌效果好，可能是因為不同酶解時間Papain酶解Cystatin的產物不同。由此，推測實驗所得的具有抑菌活性的片段很可能是來自Cystatin的降解物，有必要對所得的目的抑菌片段做進一步鑒定。

2.3 目的抑菌片段的分離純化及抑菌效果

將酶解6 h后的重組Cystatin小肽片段通過TSK-GEL G2000SWXLHPLC進行分段收集，由圖3可知，水解后的樣在TSK圖上形成了4個不同大小的峰型，其保留時間分別為13.0 min(T-1)、21.5 min(T-2)、25.0 min(T-3)、26.0 min(T-4)，分別收集各峰，于-80 ℃冷凍干燥備用。通過濾紙片法鑒定各峰的抑菌活性，發現僅峰T-2對3種腐敗菌具有抑菌效果，其結果如圖4所示，當Cystatin的加量為15、20、25、30 μL/片時，對草莓假單胞菌抑菌圈直徑分別為12、13、15、18 mm；對腐敗希瓦氏菌抑菌圈直徑分別為16、18、20、21 mm；對中間氣單胞菌抑菌圈直徑分別為20、22、29、33 mm。

圖3 Papain酶解重組Cystatin蛋白6 h樣上TSK-GEL G2000SWXLHPLC
Fig.3 Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin for 6 h and identified by TSK-GEL G2000SWXLHPLC

a-草莓假單胞菌; b-腐敗希瓦氏菌; c-中間氣單胞菌;
A-Papain對照；B-Cystatin 15 μL/片；C-Cystatin 20 μL/片；D-Cystatin 25 μL/片；E-Cystatin 30 μL/片
圖4 TSK回收峰2對優勢腐敗菌的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of TSK peak 2 on dominant spoilage strains

2.4 目的抑菌片段的TSK-GEL G2000SWXLHPLC鑒定

將Cystatin酶解后經TSK-GEL G2000SWXL分離收集的具有抑菌效果的峰T-2的凍干粉復溶后進行檢測，結果如圖5所示，保留時間為21.5 min，根據峰尖處的Ve/V0值，經標準曲線公式計算其分子質量為8.6 ku，且純度較高。

圖5 TSK gel G2000 SWXLHPLC鑒定目的抑菌片段
Fig.5 TSK gel G2000 SWXLHPLC identification bacteriostatic fragments

2.5 雙向電泳鑒定目的抑菌片段

將目的抑菌片段經1 ku超濾杯濃縮后透析除鹽，經雙向電泳檢測，在靠近標準10 ku附近有1條單一條帶(如圖6)，可知其分子質量為8.6 ku，pI值為6.5，與Cystatin酶解結果基本一致。

圖6 目的抑菌片段的雙向電泳圖譜
Fig.6 2-DE Patterns of antimicrobial fragments

2.6 質譜鑒定目的抑菌片段

質譜產生的文件通過導入Protein Pilot 5.0 software(AB SCIEX)進行鑒定，結果見表2，其質譜圖見圖7。經質譜分析鑒定到3個肽片段，經UniProt數據庫對比后發現這2個肽片段序列與鰱魚Cystatin氨基酸序列(登記號：KF181446序列)完全相符，分別為31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，并且其中的肽段2肽序列含有Cystatin的特征序列QVAAG，因此，說明其有效抑菌片段來自鰱魚Cystatin本身酶解后的片段。

表2 目的抑菌片段的質譜鑒定結果Table 2 Identification of bacteriostatic fragments of thetarget

注：1)得分：ProteinPilot軟件得分，>1.3即為可信；2)95%覆蓋率：可信度大于95%的肽段占整個蛋白的覆蓋率；3)95%置信區間：置信區間大于95%的肽段數，一般最好取≥2的肽鏈，1個也可接受。

a-序列: QQQVAAGMK; b-序列: QSNDAFVR; c-序列: NPSIEQVIQCK
圖7 Papain酶解Cystatin抑菌肽片段質譜圖
Fig.7 A mass-spectrogram of Bacteriostatic Fragments of Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin

3 討論

目前，已有大量的研究報道了重組Cystatin具有抑菌作用，如人重組Cystatin 9能抑制土拉桿菌(Francisellatulareusis)的生長[8]，重組莧菜Cystatin可以抑制多種植物病原真菌[32]，以及甘蔗重組Cystatin能抑制里氏木霉(Trichodermareesei)的生長[33]。而關于魚類Cystatin(家族II)的抑菌作用鮮有報道[22, 34]。

Cystatin作為一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其對細菌的抑制機制，主要涉及以下幾個方面。其一是通過抑制細菌分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Proteinase，CP)而發揮抑菌作用[30]。其二可能是Cystatin可穿透細胞膜進入細胞質，擴散到細胞內部抑制其細胞內蛋白酶的水解活性[2]。其三可能是Cystatin的N端與CP相互作用的保守序列，能與細菌生物膜上的負電荷相結合而發揮抑菌作用[35]。其四，Cystatin內部具有的抑菌氨基酸序列，這些抑菌片段可能干擾了微生物的肽轉運系統[24]，而與Cystatin抑制CP無關[36-37]。綜上可見，Cystatin抑菌也可能是多種機制聯合作用的結果。

本實驗中，Cystatin經適宜時間(6 h)酶解后的產物，相對于0、12、24 h組，對3種優勢腐敗菌的抑菌效果最好，因此推測此時具有抑菌活性的片段很可能被完全釋放出來。本實驗鰱魚重組Cystatin酶解后分離得到分子質量約為8.6 ku的目的抑菌肽段，而通常Cystatin(家族II)的分子質量通常約為12～14 ku，因此判斷其為Cystatin的酶解產物。此外，經質譜鑒定到的3個肽序列，分別位于鰱魚Cystatin序列中的31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，再次證明該8.6 ku的目的抑菌肽來自于鰱魚Cystatin的酶解，即鰱魚Cystatin蛋白內部，存在能夠發揮抑菌作用的肽片段。同時，鰱魚Cystatin的N端起始氨基酸殘基至第89個氨基酸殘基(Q89)，該片段的分子質量為9.986 ku，這也暗示該8.6 ku片段N端可能遭到了水解破壞，其N端氨基酸并非鰱魚Cystatin的起始氨基酸，故推測其抑菌機制可能不包括通過N端序列結合菌體而發揮作用的可能性，可能是與其內部序列有關。此外，由于該目的抑菌片段為小分子片段(8.6 ku)，因此可能更容易穿透細胞膜進入細菌內部從而發揮抑制作用。鑒于Cystatin的多種抑菌機制，鰱魚重組Cystatin及其酶解產物對優勢腐敗菌的具體抑菌機制，還有待進一步深入探究。