莠去津降解菌的篩選及其降解特性研究

馮瑞章，杜永華，魏琴，周萬海，何飛，黃彭，李莉

1(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644000)

莠去津(atrazine)化學(xué)名稱為 2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5- 三嗪，是一種可有效防除闊葉雜草和禾本科雜草的選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[1]。目前已被歐盟等國(guó)家禁用，但在我國(guó)西南地區(qū)，莠去津與其他農(nóng)藥的混用品仍然作為玉米、高粱、水稻等農(nóng)作物的主要除草劑[2]。莠去津?yàn)檗r(nóng)業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，導(dǎo)致土壤、地表水、地下水、空氣等嚴(yán)重污染，環(huán)境和食物鏈中的莠去津?qū)θ祟惡蛣?dòng)物生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)等有極大的不利影響，是潛在的致癌物質(zhì)[3]。目前，莠去津的礦化、生物降解已受到廣泛關(guān)注。研究表明，包括Pseudomonas(假單孢菌)、Bacillus(桿菌)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌)、Agrobacterium(土壤桿菌)、Arthrobacter(節(jié)細(xì)菌)、Stenotrophomonas(寡養(yǎng)單胞菌)等的微生物能以莠去津?yàn)樘荚础⒌醇澳茉次镔|(zhì)對(duì)其進(jìn)行降解[4-6]。

近年來，隨著包括莠去津等除草劑的大量使用，以植物產(chǎn)品(小麥、玉米、高粱、大米和糯米)為主要原料，以水源、大氣、生態(tài)環(huán)境條件為主要影響因子的白酒品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，對(duì)外貿(mào)易受到嚴(yán)格限制。食品在發(fā)酵過程中，微生物對(duì)農(nóng)藥殘留具有明顯的降解作用[7-8]。課題組在前期研究中，通過對(duì)白酒糟醅進(jìn)行噴施莠去津，誘導(dǎo)分離得到28株微生物菌株，本文以此為材料，篩選高效莠去津降解菌株，研究其降解莠去津的能力和性能，為莠去津降解菌的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及藥劑

供試菌株為經(jīng)莠去津農(nóng)藥誘發(fā)、富集培養(yǎng)后分離自濃香型白酒糟醅的28株細(xì)菌(分離于2016年9月)，保存于宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。莠去津質(zhì)量分?jǐn)?shù)(99%)原藥，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

純化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，胰蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖10，MgSO4·7H20 0.03，CaCl2·2H2O 0.003；蒸餾水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO42.4，KH2PO41.2，NH4NO31，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.025,Fe2(SO4)30.008；蒸餾水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

綜上所述，我院采取綜合干預(yù)措施，使清潔手術(shù)圍手術(shù)期預(yù)防使用抗菌藥物趨于合理規(guī)范，綜合干預(yù)措施有力，成效明顯。

1.2 方法

1.2.1 莠去津降解菌株篩選及降解能力測(cè)定[6]

將28株純化、編號(hào)后的供試菌株接種于含有100 mg/L莠去津原藥的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)于莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，繼續(xù)轉(zhuǎn)代3次，至培養(yǎng)基中莠去津質(zhì)量濃度增至500 mg/L時(shí)還能生長(zhǎng)的菌株，即為具有莠去津降解潛能的菌株。

將篩選到的具有莠去津降解潛能的菌株制備菌懸液(菌數(shù)約為109個(gè)/ mL)，按2%的接種量接種于50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，連同菌體轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，用60 mL二氯甲烷萃取3次，下層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉合并于250 mL平底燒瓶中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35 ℃)上減壓濃縮至近干，氮?dú)獯蹈珊笥蒙V甲醇定容至10 mL，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定莠去津的殘留量[9]，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=55∶45，流速1 mL/min，進(jìn)液量20 μL。

降解率%=

每株菌3次重復(fù)，以不接種為對(duì)照。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和莠去津降解動(dòng)態(tài)

將莠去津降解能力較高的菌株制備菌懸液，按2%的接種量接種于50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)，分別在0、12、24、48、72、96、120 h時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值和殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不接種為對(duì)照。

1.2.3 共代謝物對(duì)菌株降解莠去津能力的影響

在50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入0.5%的不同碳源(檸檬酸鈉，丁二酸，葡萄糖，蔗糖)，調(diào)節(jié)pH值為6，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不加共代謝物為對(duì)照。

1.2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株降解莠去津能力的影響

在莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過分別改變接種量(0.1%、0.5%、1%、2%、5%)、莠去津質(zhì)量濃度(25、50、100、200、500 mg/L)、培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40 ℃)、pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和裝液量(25、50、75、100、125 mL)，在其他條件不變的情況下，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不接種為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津降解菌的篩選

對(duì)前期分離保存的28株細(xì)菌在不同濃度的莠去津平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)10株菌能以莠去津?yàn)槲ㄒ惶荚春湍茉丛谫|(zhì)量濃度為500 mg/L的培養(yǎng)基上生存，占到總供試菌株數(shù)量的18.9%，說明這些菌株對(duì)莠去津有較高的耐受能力和降解的潛能。

通過液體培養(yǎng)對(duì)篩選到的10株菌進(jìn)行液相色譜檢測(cè)和莠去津降解率的計(jì)算，由圖1可知，菌株對(duì)莠去津的降解能力存在較大差異，其中降解率大于30%的有4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33，降解率分別為38.1%、34.6%、37.3%和41.1%)，降解率為20%～30%和小于20%的分別有4株菌(XQB-4、XQB-11、XQB-15、XQB-24)和2株菌(XQB-13、XQB-36)。在10株菌中，XQB-33的降解率最高(41.1%)，是降解率最低菌株XQB-33(13.3%)的3.1倍。為進(jìn)一步挖掘莠去津降解菌的功能，選取降解率大于30%的4 株菌研究其降解性能。

圖1 菌株的莠去津降解率
Fig.1 The atrazine degradation rate of strains

2.2 菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和莠去津降解動(dòng)態(tài)

微生物可利用莠去津作為碳源、氮源，通過使底物發(fā)生脫烷基、脫N-烷基、三氮環(huán)開裂等釋放出CO2而發(fā)生徹底礦化降解[10-11]。4株菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和莠去津降解動(dòng)態(tài)結(jié)果表明(圖2)，在培養(yǎng)前期(0～24 h)，4株菌生長(zhǎng)均較緩慢，幾乎沒有降解莠去津的能力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)速度加快，莠去津的降解率也逐漸升高，在72 h時(shí)，4株菌的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，莠去津的降解率亦達(dá)到峰值，隨后各菌株的OD600值和降解率逐漸降低，表明4株菌的生長(zhǎng)和功能發(fā)揮趨于同步。

圖2 菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)(A)及莠去津降解動(dòng)態(tài)(B)
Fig.2 The dynamics of growth(A) and degradation rate(B) of strains

2.3 共代謝物對(duì)菌株降解莠去津能力的影響

微生物共代謝作用是農(nóng)藥發(fā)生降解的重要代謝機(jī)制[12]。由圖3可知，加入共代謝物葡糖糖和檸檬酸鈉后，4菌株的莠去津降解率均有不同程度的提高，特別是添加葡萄糖后，XQB-1的降解率由37.9%提高到53.1%，XQB-33的降解率由46.6%提高到60.7%；添加共代謝物蔗糖和丁二酸后，除XQB-1的莠去津降解率略有下降外，其他3菌株都有一定提高，表明共代謝物的添加對(duì)菌株降解莠去津的能力有一定促進(jìn)作用。

圖3 共代謝物對(duì)菌株降解莠去津的影響
Fig.3 Effects of co-substrates on degradation rate of strains

2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株降解莠去津能力的影響

將供試的4菌株通過分別改變接種量、莠去津濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和裝液量，在其他條件不變的情況下，培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌株的莠去津降解率結(jié)果見圖4。

圖4 環(huán)境條件對(duì)菌株降解莠去津能力的影響
Fig.4 Effects of environmental conditions on degradation rate of strains

隨著培養(yǎng)基中接種量的增加，4株菌的莠去津降解率均呈現(xiàn)先增加，后降低的趨勢(shì)，且都在接種量為2%時(shí)莠去津降解率最高，說明2%的接種量為最適接種量(圖4-A)。可能是由于隨著接種量的增加，菌體數(shù)量增多，在培養(yǎng)前期，培養(yǎng)液能為菌體生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；但是到了培養(yǎng)后期，隨著菌種的大量繁殖，培養(yǎng)液所提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，抑制了菌體生長(zhǎng)及降解酶的產(chǎn)生和莠去津的降解。

底物濃度對(duì)4菌株降解能力具有較大的影響(圖4-B)。XQB-21和XQB-25均在莠去津質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)的降解率最高，分別為33.6%和35.9%，XQB-1和XQB-33則在莠去津濃度為200 mg/L時(shí)的降解率最高，分別為37.9%和46.5%，說明低濃度時(shí)，莠去津濃度增加對(duì)菌株的降解能力具有促進(jìn)作用，高濃度的莠去津則對(duì)菌株的降解能力具有抑制作用。

由圖4-C可知，4菌株對(duì)莠去津的降解能力隨培養(yǎng)溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，30 ℃是4菌株的最適培養(yǎng)溫度，在20～30 ℃范圍內(nèi)，降解率隨溫度的升高而增加，在30 ℃時(shí)，4菌株的降解能力均達(dá)到最大；30 ℃后，降解率隨溫度的升高而減少，40 ℃的高溫下培養(yǎng)，XQB-21和XQB-25的培養(yǎng)液會(huì)伴有菌體沉淀產(chǎn)生，在生長(zhǎng)量上表現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，表明這2株菌不能夠在高溫下長(zhǎng)時(shí)間的生存。

在同一規(guī)格和型號(hào)的150 mL三角瓶中添加不同體積的培養(yǎng)基，依培養(yǎng)基體積按比例接種4株降解菌，考察裝液量對(duì)其降解率的影響(圖4-D)。在不同的裝液量下，4株菌都有一定的降解莠去津能力，說明它們均不是專性好氧或?qū)Ｐ詤捬跷⑸铩QB-1和XQB-33在裝液量為100 mL時(shí)表現(xiàn)最高的降解率，XQB-21和XQB-25在裝液量為75 mL時(shí)表現(xiàn)最高降解率，且裝液量為125 mL時(shí)的降解率明顯高于25 mL和50 mL裝液量時(shí)的降解率，說明這些菌株對(duì)氧的敏感性不高，能夠在相對(duì)缺氧的環(huán)境中生存并發(fā)揮較強(qiáng)的降解莠去津能力，這可能與菌株來源有關(guān)。

培養(yǎng)基的初始pH值條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)和莠去津的降解有很大的影響(圖4-E)。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為8和9時(shí)，培養(yǎng)72 h離心后發(fā)現(xiàn)基本無菌體，說明偏堿條件不適宜降解菌的生長(zhǎng)。當(dāng)初始培養(yǎng)基pH值小于等于7時(shí)，各菌株降解莠去津的能力才有明顯增加，菌株XQB-1和XQB-21在pH值為5的培養(yǎng)基中降解率最高，分別為37.9%和34.1%，XQB- 25和XQB-33在pH值為6的條件下降解率最高，分別為35.4%和49.7%；當(dāng)pH值為3時(shí)，4菌株的降解率又較最高降解率降低了13.8%～24.38%，表明這4株菌適宜在偏酸環(huán)境生長(zhǎng)，可能跟菌株來源于白酒糟醅的酸性環(huán)境有關(guān)。

3 討論

微生物降解是環(huán)境中殘留莠去津的主要降解方式。細(xì)菌由于其生理生化的多種適應(yīng)能力及易誘發(fā)突變菌株，在降解莠去津的微生物中占有重要地位。目前，已篩選出各類能夠礦化莠去津的降解菌，例如Nocardioidessp.DN36菌株經(jīng)過56 d可完全降解莠去津[13]，Arthrobactersp.GZK-1降解莠去津需要14 d[14]。本研究通過富集培養(yǎng)，從濃香型白酒糟醅中初篩到10株具有降解莠去津潛能的菌株，液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，這些菌株的莠去津降解率為13.3%～41.4%，其中4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33)的降解率超過30%。

4株菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和莠去津降解動(dòng)態(tài)結(jié)果表明，培養(yǎng)72 h時(shí)，4株菌的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，莠去津的降解率達(dá)到峰值，隨后菌株的OD600值和莠去津降解率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。微生物降解莠去津的實(shí)質(zhì)是降解酶作用下的酶促反應(yīng)過程[15]，在培養(yǎng)初期，菌株要適應(yīng)莠去津農(nóng)藥環(huán)境，并誘導(dǎo)體內(nèi)降解酶的生成，因此，菌體數(shù)量和降解率均較低；隨著菌體數(shù)量的增加，降解酶產(chǎn)生量亦逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，菌體數(shù)量和降解酶產(chǎn)量達(dá)到最高值，降解率隨之達(dá)到峰值；培養(yǎng)后期，細(xì)菌生長(zhǎng)變緩，菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，部分被菌體細(xì)胞吸收的莠去津被逐漸釋放出來，導(dǎo)致72 h后莠去津的降解率逐漸下降。

微生物可通過生長(zhǎng)代謝將農(nóng)藥作為碳源或氮源加以利用和分解，亦可通過共代謝方式利用其他底物獲取大部分或全部的碳源和能源，改變農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其降解[16]。加入共代謝物可以提高菌株降解莠去津的能力，特別是葡萄糖的添加可使菌株的莠去津降解率大幅升高[17]。

本研究中，供試4菌株對(duì)莠去津的最適降解條件為接種量為2%、莠去津質(zhì)量濃度100～200 mg/L、培養(yǎng)基初始pH值為5～6、培養(yǎng)溫度為30 ℃、裝液量為75～100 mL/150mL。說明微生物對(duì)莠去津的降解，除與菌株自身的屬性和莠去津的性質(zhì)外，還受環(huán)境條件如培養(yǎng)溫度、接種量、pH值等的影響[18]。

目前，雖然從環(huán)境中獲得了許多可降解莠去津的各類真菌和細(xì)菌，但對(duì)各類微生物降解過程中所涉及的中間代謝產(chǎn)物、酶及相應(yīng)的基因的研究并不深入。因此，從環(huán)境中富集分離莠去津高效降解微生物和研究其降解機(jī)理都是今后的主要研究方向。