大目金槍魚皮膠原明膠化過程中酸堿濃度對明膠理化性質的影響

孫藝，韓霜，馬良,2，蔡路昀，張宇昊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶， 400715)2(西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶， 400715) 3(渤海大學 食品科學與工程學院,遼寧 錦州， 121013)

明膠是膠原蛋白部分降解產生的高分子化合物，因其具有乳化性、凝膠熱可逆性、成膜性等特點而被廣泛應用于乳品、糖果及包裝材料等食品工業領域。膠原蛋白的基本結構單位是原膠原分子，每個原膠原分子由3條自成左手螺旋的α-肽鏈通過氫鍵相互纏繞成右手超螺旋, 形成“三螺旋結構”。膠原明膠化過程是破壞穩定和維系膠原三螺旋結構的共價交聯和非共價鍵, 使膠原的三螺旋結構展開，非螺旋結晶區被破壞, 以利于后期熱處理過程中膠原亞基分子的釋放[1]。酸堿處理可以誘導膠原明膠化，主要是通過酸或堿與膠原分子上的堿性基團或酸性基團結合，從而使得維系膠原三螺旋結構的氫鍵被破壞，進而有利于后期熱處理過程中膠原亞基分子的釋放[2]。根據之前的報道，原料種類不同，酸堿處理對膠原明膠化的影響效果也不盡相同，周夢柔[3]通過酸處理誘導豬皮膠原明膠化時發現1 h和4 h的酸處理對膠原結構的降解作用十分有限，三螺旋結構保存仍相對完整，亞基分子不能充分釋放，而于瑋[4]研究兔皮膠原明膠化機制時卻發現僅通過5 min的酸處理即可有效促進膠原中亞基分子的釋放。

金槍魚，又稱鮪魚、吞拿魚，是一種大型遠洋性重要商品食用魚，生活于太平洋、大西洋和印度洋等暖水海域，屬于大洋性洄游魚類。金槍魚總產量巨大，但在生產過程中產生的許多廢棄物如皮、骨等，大部分都被丟棄，造成了很大的浪費。以這些下腳料為原料提取出高質量的明膠，并將其應用于食品和制藥工業等領域，不僅可以從宗教和疾病等角度克服傳統明膠如豬皮明膠、牛皮明膠等在應用上的局限，還可以大大增大金槍魚下腳料的價值，對發展整個金槍魚產業意義深遠。

目前對于金槍魚皮明膠的研究國外已有一些相關報道，絕大部分是以黃鰭金槍魚皮明膠為研究對象。CHO等[5]以黃鰭金槍魚背部皮膚為原料，采用響應面方法優化明膠的提取工藝，最終確定的提取工藝為質量濃度為1.89%的NaOH浸泡2.87 d，隨后用6 mol/L的HCl中和處理，58.15 ℃提取4.72 h，在此工藝下所得明膠的凝膠強度達429.1 g，明膠得率為89.7%(以羥脯氨酸含量計)。KARAYANNAKIDIS等[6]也對黃鰭金槍魚背部皮明膠提取工藝進行了研究，得出0.2 mol/L NaOH浸泡魚皮1 h，清水洗凈后，0.1 mol/L乙酸處理1 h，隨后在55 ℃條件下提取6 h，所得明膠質量較優。GMEZ-ESTACA等[7]研究發現金槍魚皮明膠同牛皮明膠一樣，都具有較好的成膜性，金槍魚皮明膠膜的水蒸氣透過率低于牛皮明膠膜，但斷裂變形值是牛皮明膠膜的10倍以上，這是由于牛皮明膠中更高的亞氨基酸含量賦予了牛皮明膠膜更高程度的剛度從而導致較低的斷裂變形值。

大目金槍魚(Bigeye Tuna)，又稱大眼金槍魚，是金槍魚屬中產量第二大的品種，年產量約45萬t，占全球金槍魚總產量的10%左右[8]。目前對于大目金槍魚皮明膠提取與性質方面研究很少，在大目金槍魚皮膠原明膠化方面更是未見報道。

本研究以大目金槍魚魚皮為原料，重點研究明膠提取過程中酸堿濃度對魚皮膠原明膠化的影響，旨在為金槍魚皮明膠生產工藝參數的合理控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚皮，山東中魯遠洋(煙臺)食品有限公司(捕撈海域：太平洋(FAO 77海域))；羥脯氨酸(分析純)，楷洋生物技術(上海)有限公司；高氯酸(分析純)，鑫源化工(天津)有限公司；冰乙酸、NaOH、異丙醇、十二烷基苯磺酸鈉(分析純)，科龍化工(成都)試劑廠；對二甲氨基苯甲醛(分析純)，科密歐化學試劑(天津)有限公司：豬皮明膠(分析純)，美國Sigma公司；Tris、考馬斯亮藍R-250(優級純)，BIO BASIC公司；質量分數為30%丙烯酰胺(優級純)，索萊寶科技(北京)有限公司；甘氨酸(glycine)(分析純)，生工生物工程(上海)有限公司；標準蛋白(分子質量10～200 kDa)(分析純)，加拿大Fermentas公司；KBr(光譜純)，市科龍化工(成都)試劑廠。

1.2 儀器與設備

電子天平(JA3003B)，精天電子儀器(上海)有限公司；數顯酸度計(PHS-25)，雷磁分析(杭州)儀器廠；馬弗爐(4-6)，永光明(北京)儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱(101-4-S)，躍進醫療(上海)器械廠；溫控水浴鍋(8002)，永光明醫療(北京)儀器廠；紫外-可見分光光度計(752),菁華科技儀器(上海)有限公司；質構儀(CT-3)，美國博勒飛公司；基礎電泳儀(Power PacTM)，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(G:BOX EF)，英國Syngene公司；紅外光譜儀(Spectrun100)，美國PerkinElmer公司；離子濺射儀(HITACHI E1010)，日本日立儀器公司；掃描電子顯微鏡(S-3000N型)，日本日立儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金槍魚皮基本成分測定

水分含量的測定：按照GB5009.3—2010進行測定，直接干燥法；粗脂肪含量的測定：按照GB/T 14772—2008進行測定，索氏提取法；粗蛋白含量的測定：按照GB 5009.5—2010進行測定， 凱氏定氮法；灰分含量的測定：按照GB 2009.4—2010進行測定，馬弗爐高溫灼燒法；膠原蛋白含量的測定(以羥脯氨酸計，轉換系數為14.799[9])：按照GB/T 9695.23—2008進行測定，分光光度法。

1.3.2 金槍魚皮明膠的提取

(1)金槍魚皮明膠提取工藝流程

魚皮→去鱗去骨洗凈→剪碎→漂洗、瀝干→脫脂→水洗→堿處理→水洗→酸處理→水洗→提膠→抽濾→干燥→明膠成品

基礎工藝條件參照KARAYANNAKIDIS等[6]方法并做一些改進：魚皮經去鱗去骨洗凈后，剪碎、漂洗瀝干，以十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)超聲脫脂2 h[10]，水洗后，以質量分數為0.8%的NaOH溶液處理1 h，每30 min換1次液。用清水洗滌數次，然后用乙酸溶液(0.5%)處理1 h。水洗至pH至4.5左右，在55 ℃條件下提膠6 h，濾除皮渣后，抽濾，60 ℃烘干24 h，得到明膠成品。

(2)金槍魚皮明膠提取的單因素試驗

金槍魚皮明膠提取的基本條件為堿處理時間1 h、堿溶液質量分數0.8%、酸處理時間1 h，酸溶液質量分數0.5%。固定其他條件并改變其中一個條件，以分析上述條件的影響。各因素梯度分別為：堿溶液質量分數0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酸溶液質量分數0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。每個因素做3次重復實驗，結果選取平均值。

(3)明膠得率

(1)

(4)明膠凝膠強度的測定

按照GB6783—2013《食品添加劑 明膠》中測定凝膠強度的方法，配制明膠溶液(質量分數為6.67%)，并在(10±0.1)℃恒溫循環器中凝凍16～18 h。選用TA5圓柱型探頭，下壓速度1 mm/s，下壓距離4 mm，得出凝膠強度數值，結果取整數。

1.3.3 明膠化膠原的制備

稱取一定質量的金槍魚皮，經十二烷基苯磺酸鈉超聲脫脂后，加入一定質量分數的氫氧化鈉溶液浸泡1 h，清水沖洗3次后，浸入一定濃度的乙酸溶液中，浸泡2 h，隨后清水洗凈，凍干備用。固定其他條件以制備酸液濃度、堿液濃度不同的2組明膠化膠原樣品，各組的梯度(質量分數)分別為，堿處理組：0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酸處理組：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，將經過超聲脫脂后的金槍魚皮洗凈，冷凍干燥作為未處理組膠原樣品。

1.3.4 紅外光譜掃描

將冷凍干燥后的未處理膠原、堿處理組和酸處理組明膠化膠原剪碎。稱取1 mg固體膠原樣品與100 mg KBr混合研磨，直至樣品與KBr完全磨成粉末狀，烘干后壓片，用紅外光譜儀掃描400～4 000 cm-1的吸收光譜，掃描次數32次，分辨率4 cm-1。用Spectrum和Origin 8.0軟件去卷積，高斯擬合1 600～1 700 cm-1波段。

1.3.5 明膠化膠原電鏡分析

分別從未處理、質量分數為0.3%的堿液處理、質量分數為0.8%的堿液處理、質量分數為1.0%酸液處理、質量分數為2.0%酸液處理的明膠化膠原樣品中選取一定大小的樣品，用專用的雙面膠固定，HITACHI E1010 離子濺射儀噴金處理50 s，使用電子顯微鏡觀察各個樣品的微觀結構。

1.3.6 明膠、明膠化膠原SDS-PAGE電泳分析

實驗參照陳麗清等[11]的方法進行。采用6%的分離膠，電泳結束后用考馬斯亮藍染色2 h，然后用脫色液直至背景脫凈，結果用Gene Tools (Syngene, Cambridge, UK)軟件分析圖譜。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0和Spectrum進行數據處理，并用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 金槍魚皮基本成分分析

如表1所示，金槍魚皮粗蛋白含量為35.70%，膠原蛋白含量為30.96%，占總蛋白含量的86.72%。金槍魚皮膠原蛋白含量較高，是一種較為理想的提取明膠的原料。

表1 金槍魚皮基本成分表Table 1 Major components of tuna skin

2.2 堿液濃度對所提取明膠質量的影響

堿處理可以使堿與脂肪發生皂化反應，除去部分的脂肪，同時還可以除去部分雜蛋白及色素，使溶解的非膠原物質在清洗時隨廢液除去，達到提高明膠質量的要求[12]。從圖1中可以看出，在試驗范圍內，隨著NaOH質量分數的增加，明膠得率呈現出先上升后下降的趨勢。當堿液質量分數為0.8%時，明膠得率達到最大值，為14.55%。凝膠強度隨堿液質量分數的增加變化的趨勢與明膠得率的趨勢一致，只是凝膠強度的最大值出現在堿液質量分數為0.8%～1.8%，三者之間差異不顯著(p>0.05)。這可能是因為堿處理破壞了膠原蛋白結構[13]，使其在后期的熱水提膠中，膠原亞基易于溶出，從而得到較高得率與凝膠強度的明膠。但當堿液濃度過高時，膠原會降解為更小的分子，在水洗過程中流失，從而明膠得率下降。同時因為明膠中小分子含量增加，凝膠強度也隨之降低。此外，在試驗過程中，堿液濃度越大，堿處理過后所得的魚皮顏色越黃，所得的明膠顏色也更偏黃。故綜合考慮，0.8%為較優堿溶液質量分數。

圖1 堿液質量分數對明膠得率和凝膠強度的影響
Fig.1 Effcet of different alkali concentrations on yield and gel strengh of gelatin

2.3 酸液濃度對所提取明膠質量的影響

由圖2可知，酸溶液質量分數0.5%～2%時，明膠得率呈現上升的趨勢，并在酸溶液質量分數在2%達到最大，此時的明膠得率為17.50%。當酸溶液質量分數大于2.0%時，明膠得率開始下降。明膠的凝膠強度也隨著酸溶液質量分數的增加而先增大后減小。這是由于酸質量分數低于2.0%時，酸不僅可以中和魚皮中殘留的氫氧根離子，還可以使魚皮充分吸水溶脹，與膠原中的堿性基團結合，進一步破壞膠原中的離子交聯與氫鍵，促進膠原亞基的釋放，進而提高明膠得率。但當酸質量分數高于2.0%時，隨著酸濃度進一步增加，膠原亞基可能被進一步降解成小分子組分，更易浸出魚皮，隨著水洗液而流失，明膠得率不但不會增加反而降低。此外，魚皮中的某種內源性熱激活蛋白酶，在熱水提膠時被激活，并將分子降解成短肽小分子，因而降低了明膠的凝膠強度[14-15]。當酸濃度高時，內源性蛋白酶失活，對凝膠強度無影響。故酸溶液質量分數在2.0%左右為較優條件。

圖2 酸液質量分數對明膠得率和凝膠強度的影響
Fig.2 Effcet of different acetic acid concentration on yield and gel strengh of gelatin

2.4 明膠化膠原紅外分析

2.4.1 堿處理組明膠化膠原紅外分析

不同濃度的堿處理后的明膠化膠原的結構變化紅外光譜圖如圖3所示。

圖3 堿處理組明膠化膠原紅外光譜
Fig.3 FTIR spectra of gelatinized collagen treated with different concentrations of alkali

表2 堿處理組明膠化膠原酰胺帶吸收峰位置Table 2 The absorbance positions of amide band ofgelatinization collagens treated with differentconcentration of alkali

酰胺Ⅲ帶的吸收峰代表著C—N的伸縮振動和骨架N—H的彎曲振動，以及肽鏈骨架上和脯氨酸中的CH2的搖擺振動，與膠原的三螺旋結構有關。膠原自組裝成三螺旋結構，則酰胺Ⅲ帶吸收峰向低波數移動。與未處理膠原相比，堿處理組的膠原酰胺Ⅲ帶向高波數移動，說明堿處理過后膠原蛋白的三螺旋結構受到較輕微程度的破壞。研究表明，酰胺Ⅲ帶與1 454 cm-1處吸收峰強度的比值(AⅢ/A1 454)可以表示為膠原三螺旋完整性的量度[18-19]。從表2中可以看出，與未處理膠原相比，堿處理組膠原的AⅢ/A1 454值均相對減小，說明不同質量分數的堿處理均可以使膠原三螺旋結構展開，但AⅢ/A1 454值的總體變化趨勢并不明顯，可能是由于隨著堿溶液質量分數的不斷增加，膠原的降解程度不斷增加，在清洗過程中一部分小分子組分會隨廢液流失，故剩余的膠原結構穩定性相對更高，造成部分較高濃度堿處理樣品AⅢ/A1 454值反而有所增大。為深入分析不同質量分數堿處理對膠原結構的影響，對膠原的二級結構進行深入分析。

表3 堿處理組明膠化膠原二級結構相對含量Table 3 The secondary structured of gelatinization collagens treated with different concentrations of alkali

β-轉角是伸展的肽鏈結構形成180°的U型回折，其特定構象在一定程度上取決于其組成氨基酸，一般情況下，脯氨酸和甘氨酸經常存在其中。如表3所示，未處理膠原蛋白的二級結構中，β-轉角含量最高，達63.94%，這可能是由于膠原蛋白中含有較高的甘氨酸和脯氨酸，同時也表明完整金槍魚皮膠原蛋白二級結構中的主要組成部分是β-轉角。經過堿處理過后的魚皮吸水溶脹，堿液進入到膠原蛋白中使其三螺旋結構松散，維持三螺旋結構的一些非共價鍵被破壞，肽鏈開始伸展。堿溶液質量濃度在0.3%～1.8%時，大部分β-轉角降解轉化成α-螺旋與β-折疊。隨著堿處理質量分數的增大，對膠原的降解程度逐漸增加，一方面，膠原不斷被降解為小分子而溶于溶液中，在清洗的過程中隨著廢液流失，另一方面，清洗過后剩余膠原結構穩定性相對較高，不利于亞基的釋放，這兩方面的因素使得在堿處理質量分數高于0.8%后明膠得率逐漸降低，也是堿處理質量分數高于0.8%時，AⅢ/A1 454值出現增大的原因。質量分數增加大至2.3%時，α-螺旋與β-折疊向β-轉角和無規則卷曲轉化，膠原無序化程度增加，此時熱處理過程中膠原向明膠轉化將更加容易，但由于此時濃度過高，清洗損失的程度增大，所以明膠得率依舊在下降。此外，經過堿處理過后的明膠化膠原中α-螺旋與β-折疊含量增加，這2種結構中存在較多的氫鍵[20]，故其內部氫鍵作用加強，與在譜圖中觀察到氫鍵作用加強一致。

2.4.2 酸處理組明膠化膠原紅外分析

從圖4中可以清楚地看到未處理組與酸處理組明膠化膠原的3個譜帶，即波數在3 400 cm-1附近的酰胺A帶，波數在1 600～1 700 cm-1酰胺Ⅰ帶，波數在1 200～1 300 cm-1酰胺Ⅲ帶。如表4所示，與未處理膠原相比，酸處理組明膠化膠原的酰胺A帶向高波數移動，說明膠原蛋白分子間氫鍵被破壞；酰胺Ⅰ帶向低波數移動，表明膠原蛋白分子內氫鍵作用加強；原有的氫鍵被打破，新的氫鍵形成，導致膠原蛋白結構發生變化。酰胺Ⅲ帶吸收峰向高波數移動，酸處理組AⅢ/A1 454值均小于未處理膠原，說明不同濃度的酸處理使得膠原蛋白三螺旋結構松散。同不同質量分數堿處理對膠原結構的影響一樣，AⅢ/A1 454值與不同質量分數的酸處理明膠得率不一致，可能也與清洗損失有關。

圖4 酸處理組明膠化膠原紅外光譜
Fig.4 FTIR spectra of gelatinized collagen treated with different concentrations of acetic acid

表4 酸處理組明膠化膠原酰胺帶吸收峰位置Table 4 The absorbance positions of amide band ofgelatinization collagens treated with differentconcentration of acetic acid

二級結構分析結果見表5，未處理膠原中含有較高含量的β-轉角。經過酸處理后，三螺旋結構逐漸松散，各二級結構相對含量發生變化，β-轉角逐漸向α-螺旋、β-折疊與無規則卷曲轉化。酸處理質量分數為0.5%～2.0%時，隨著酸濃度的增加，無規則卷曲含量增加，膠原的無序結構增加，更易于熱處理過程中膠原向明膠的轉化，明膠得率逐漸升高。酸處理質量分數增大至2.5%時，過高濃度的酸處理造成了膠原的不利降解，清洗損失率增大，明膠得率較低，但膠原清洗后剩余的一部分組分之間可能形成了更加穩定的結構，因而AⅢ/A1 454值增大，明膠得率降低。酸處理過后，氫鍵含量高的α-螺旋與β-折疊結構增多，膠原分子間氫鍵作用增強，剛好解釋了酰胺Ⅰ帶向高波數移動的原因。

表5 明膠化膠原二級結構相對含量Table 5 The secondary structured of gelatinization collagens treated with different concentrations of acetic acid

2.5 明膠化膠原電鏡分析

為進一步探究不同濃度的酸處理、堿處理對膠原結構的破壞機制，試驗對未處理(a)、僅0.8%堿處理(b)、0.3%堿處理+2.2%酸處理(c)、0.8%堿處理+2.2%酸處理(d)、0.8%堿處理+1.0%酸處理(e)、0/8%堿處理+2.0%酸處理(f)六組明膠化膠原樣品進行電鏡掃描，如圖5所示。

由圖5可以看出，未處理組膠原表面是光滑平整的，完整性較好。堿處理過后的明膠化膠原樣品表面有輕微程度的破碎。堿處理主要是降解膠原中的非共價鍵，而酸水解優先斷裂膠原中的共價鍵[21]，故堿處理對膠原蛋白造成了輕微的降解，但程度較小，所以堿處理后需要繼續進行酸處理過程。繼續對樣品進行酸處理后，膠原繼續被降解，明膠化膠原呈無規則卷曲狀。從經過質量分數為0.3%，0.8%堿處理后的明膠化膠原的電鏡掃描圖中(c和d)可以看出，當堿處理質量分數為0.8%時，膠原降解程度更大；同樣，經過質量分數為1.0%(e)與2.0%(f)酸處理的明膠化膠原中，進行質量分數為2.0%的酸處理，膠原表觀被破壞更明顯。

2.6 明膠亞基組成及降解

2.6.1 堿處理組明膠亞基組成及降解

通過SDS-PAGE電泳探究堿處理組明膠的亞基組成及其分子質量分布，結果如圖6所示。由圖6可以看出，堿處理組明膠均由α1鏈，α2鏈，β1組分，β2組分，γ組分及一些小分子組分組成。研究表明，SIMS等[22]認為，形成穩定的凝膠的要求是游離α鏈通過相互交聯，先產生短的三螺旋，進而繼續聯結形成網絡凝膠，而不是形成幾乎完整的三股螺旋，快速形成完整的三螺旋結構可能會減少必要的交互作用，從而使得凝膠的凝膠強度減小。因此，明膠中α鏈含量越高，明膠凝膠強度越好。根據泳道條帶的深淺可知，堿處理質量分數為0.3%時，明膠中α鏈含量略低，這可能是由于堿處理濃度較低時，對膠原三螺旋結構破壞程度較輕，因而熱處理過程中高分子質量組分的溶出量也較少。同時，0.3%處理組明膠中小分子組分較多，是因為較低濃度的堿處理不能抑制魚皮中內源性蛋白酶的活性，而內源性蛋白酶的存在可以使明膠降解為小分子[23]，因而所得明膠的凝膠強度較低。逐漸增大堿處理質量分數，高分子質量組分含量逐漸增大。堿處理質量分數為0.8%，1.3%，1.8%的高分子質量組分含量差異不大，與凝膠強度變化的趨勢趨于一致。堿處理質量分數為2.3%時，明膠凝膠強度下降，從圖譜中看來，可能是亞基組分中β鏈含量過高，α鏈含量相對降低的緣故。

a-未處理;b-僅0.8%堿處理;c-0.3%堿處理+2.2%酸處理;d-0.8%堿處理+2.2%酸處理；e-0.8%堿處理+1.0%酸處理;f-0/8%堿處理+2.0%酸處理。從左至右分別為放大300倍、1 500倍、5 000倍
圖5 膠原蛋白樣品的電鏡掃描圖
Fig.5 The SEM of some collagen

圖6 堿處理組明膠的SDS-PAGE電泳圖譜
Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of gelatin treated with different concentrations of alkali

2.6.2 酸處理組明膠亞基組成及降解

由圖7可以看出，酸處理組明膠亞基組分與堿處理組一致。酸處理質量分數在0.5%～1.5%范圍內，酸處理質量濃度在1.5%時，明膠中高分子質量組分最多，此時明膠凝膠強度最大。當酸處理質量分數高于2.0%后，所得明膠中的小分子組分含量逐漸增大，尤其在酸處理質量分數達到2.5%后，所得明膠的電泳條帶中小分子組分的條帶明顯增強，說明酸處理質量分數過高造成了明膠分子的不利降解，從而使得所得明膠中小分子組分含量較多，進而影響明膠的凝膠強度。

圖7 酸處理組明膠的SDS-PAGE電泳圖譜
Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis of gelatin treated with different concentrations of acetic acid

3 結論

(1)金槍魚皮粗蛋白含量為35.70%，膠原蛋白含量為30.96%，占總蛋白含量的86.72%。通過單因素試驗分析，得到提取金槍魚皮明膠的最優堿溶液質量分數為0.8%、酸溶液質量分數為2.2%。

(2)紅外分析結果表明，與未處理組膠原相比，堿處理組明膠化膠原的分子間氫鍵被破壞，分子內氫鍵作用增強，原有的氫鍵平衡的打破使得膠原蛋白的結構發生了變化，膠原的三螺旋結構松散，使得熱提膠過程中亞基容易釋放。但是由于隨著堿處理濃度的不斷增大，膠原不斷降解為小分子而溶于溶液中，在清洗時隨著廢液流失，清洗過后剩余部分的膠原結構穩定性相對較高。不同質量濃度的酸處理使得膠原原有的結構被破壞，三螺旋結構有所展開，隨著酸濃度的增加，酸處理組二級結構向無序化轉變。

(3)明膠化膠原的電鏡掃描結果顯示，堿處理可以對膠蛋白的結構造成輕微的降解，程度較輕，繼續進行酸處理過后，明膠化膠原降解程度明顯，逐漸成無規則卷曲狀。比較不同堿處理質量濃度組和酸處理質量濃度組明膠化膠原表面結構狀態后發現，堿處理質量分數為0.8%和酸處理質量分數為2.0%時，膠原表觀破壞更明顯。

(4)對不同質量分數的堿處理組和酸處理組明膠亞基組成分析表明，堿處理質量分數較低時，明膠中小分子組分含量較高。隨著堿處理質量分數增大，明膠中α鏈含量增大，堿處理質量分數至2.3%時，明膠中β鏈含量增高因而α鏈含量相對降低，導致凝膠強度降低。酸處理明膠的電泳圖譜中，酸處理質量濃度在1.5%時，明膠中高分子質量組分最多，此時明膠凝膠強度最大。當酸處理質量分數高于2.0%后，所得明膠中的小分子組分含量逐漸增大，造成凝膠強度降低。