不同熱處理方式對檸檬中酶鈍化程度及主要品質的影響

于筱雨，李少華，吳奇霄，林洪斌,*，畢秀芳，車振明，邢亞閣

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065)

檸檬(Citrus limon)又稱益母果，為常綠小喬木，蕓香科柑橘屬，富含檸檬酸、類黃酮、檸檬精油、檸檬果膠、檸檬苦素、香豆素以及維生素等，具有非常高的營養價值及藥用價值[1]。四川安岳縣的檸檬產量占到全國檸檬總產量的80%以上，目前以鮮銷為主，次級檸檬多制成檸檬干片或檸檬飲料等產品，產品種類及產量都較少，檸檬精深加工技術及產品開發需進一步加強。但是檸檬在加工過程中容易發生褐變，嚴重影響檸檬產品的品質，因此，褐變是檸檬加工產業急需解決的問題之一。

果蔬類產品，因為其中含有氧化酶類、酚類、糖類等物質，在儲存過程中，會發生酶促和非酶促褐變，顏色會逐漸加深，嚴重影響其感官品質及市場價值。褐變在檸檬加工過程中極易發生，一般有2種：一種是酶促褐變，檸檬中所含酚類物質在多酚氧化酶、過氧化物酶等的作用下，氧化成醌類物質，進而顯褐色[2-3]。酶促褐變的抑制方法，可以從3個方面考慮：減少酚類物質含量、抑制酶活以及隔絕氧氣，真空保藏[4-6]。另一種是非酶促褐變，檸檬中富含抗壞血酸和酚類物質，氧化后顏色加深。針對不同的非酶促褐變反應，應找到相應的抑制方法[7-10]。

國內外現有抑制檸檬褐變相關研究較少，COHEN[11]等為解決檸檬中褐變問題，通過測定美拉德反應中間產物羥甲基糠醛含量來確定其褐變程度，但此方法復雜且效率低；LEERATANARAK等通過比較，確定漂燙法是實際生產中抑制褐變最好的方式[12]，但對其具體熱燙方式及時間未做詳細說明；HAWA等對干燥過程中褐變對檸檬皮的影響做了研究，但對檸檬品質介紹較少[13]。

本研究主要探索鈍化酶類物質的條件，在盡可能不破壞原檸檬中營養物質的前提下，有效控制加工過程中的酶促褐變。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尤力克檸檬：采摘自四川安岳，8 ℃保藏，使用時隨取隨用。

甲醇(色譜純)、Folin-Ciocalteu試劑(指示劑)、亞甲藍(指示劑)，其他化學試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

TB-214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海益恒實驗儀器有限公司；ZNHW-2000型智能控溫電熱套，天津市工興電器廠；CP411-1型食品多功能食品加工器，廣東德爾電器有限公司；PHS-320型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；Waters 2695 HPLC，杭州瑞析科技有限公司；QP 2010 PLUS氣-質譜聯用儀，日本島津公司；WSC-S色差儀，深圳市威福光電科技有限公司；SpectraMax-i3x型酶標儀，MOLECULAR DEVICES ；KH3200E行超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；UV2800型紫外可見分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司；TDZ5-WS型離心機，上海盧湘儀。

1.3 方法

1.3.1 檸檬樣品處理

新鮮檸檬切片，厚度為3 mm，分別取200 g鮮切檸檬片于100 ℃的沸水浴及其水蒸汽中處理1、1.5、2 min，然后測其中過氧化物酶活性，通過檢測pH和色澤的直觀指標，結合還原糖、丙二醛、抗壞血酸、酚類等物質含量以及香氣成分，作為最終選擇鈍化酶條件的參考指標。

1.3.2 過氧化物酶(POD)活性測定[14]

果肉粗酶液的制備：取檸檬果肉約2 g，加磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 7)10 mL研磨，樣品經8 000 r/min，4 ℃離心10 min，上清液即為果肉粗酶液。

果肉參比液的配制：取4 mL磷酸緩沖液，加入1 mL愈創木酚溶液，40 ℃水浴預熱10 min，然后加入1 mL 2% H2O2溶液，混勻。

果肉待測液的配制：取3 mL磷酸緩沖液，加入1 mL果肉粗酶液，加入1 mL愈創木酚溶液，40 ℃水浴預熱10 min，然后加入1 mL 2% H2O2溶液，混勻。迅速在470 nm波長下進行比色測定，樣品加入后開始計時，每10 s記1次OD值，共測5 min。計算公式：

(1)

(2)

1.3.3 pH測定[15]

將檸檬果肉打漿，裝入小燒杯中，容量需足夠浸沒電極，用pH計測其pH值，讀數。

1.3.4 色澤測定[16]

取檸檬果肉10 g，研磨勻漿，采用色差儀，室溫下測定L*、a*、b*值，其中：L*代表亮度，其值越大，色澤越白；a*代表紅綠值，a*>0，表示紅色程度，a*<0表示綠色程度；b*代表黃藍值，b*>0表示黃色程度，b*<0表示藍色程度。ΔE表示總色差，通過公式(3)計算：

(3)

1.3.5 還原糖含量測定[17]

稱取2.5～5.0 g粉碎后的檸檬果肉，參考GB/T 5009.7—2008食品中還原糖的測定方法，測定檸檬中還原糖含量。

1.3.6 丙二醛的測定[18-19]

參照花生和橙汁中丙二醛的測定方法，采用熒光分光光度發檢測檸檬中丙二醛含量，并略作修改。

稱取1 g檸檬果肉，加入5 mL 100 g/L 三氯乙酸溶液，研磨勻漿，在4 ℃下8 000 r/min離心20 min，取2 mL上清液加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸溶液，混合后在沸水浴中煮沸20 min，取出后迅速冷卻，離心。分別測定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值。重復3次。根據公式(4)計算：

C(μmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450(μmol/g)

(4)

1.3.7 抗壞血酸含量測定[20]

色譜條件：C18色譜柱；二極管陣列檢測器；流動相：體積比為95∶5草酸(質量分數0.1% )∶甲醇混合液；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；測波長254 nm

樣品溶液的配制：冷缽體中加入1倍體積的草酸溶液，研磨檸檬果肉，過濾，分別取上清液2 mL置于5、10 mL容量瓶中，并用V(草酸)∶V(甲醇)=95∶5(流動相)的溶液定容。將每種質量濃度的待測樣品，用0.45 μL的一次性過濾器進行過濾，HPLC取樣量設置為20 μL，檢測時間為10 min。

1.3.8 酚類物質的含量測定[21-22]

樣品前處理：取檸檬果肉勻漿2.5 g，加入20 mL 60%的乙醇，40 ℃水浴避光超聲提取30 min，處理后樣品離心10 min，上清液定容至25 mL，搖勻4 ℃冰箱保存備用。

樣品測定：取0.5 mL待測液于與5.5 mL蒸餾水混合，加0.5 mL福林-酚試劑，混勻，再加入0.5 mL 10% NaCO3溶液，充分混合，30 ℃避光放置0.5 h，以蒸餾水為空白對照，在760 nm處測定吸光值，每個樣品平行6次。

1.3.9 揮發性香氣成分的測定[23-24]

固相微萃取：取檸檬果肉5 g，放入頂空瓶，加入3 g NaCl，放入40 ℃水浴中平衡預熱10 min后頂空吸附40 min，用萃取針收集樣品。

色譜條件：J&W DB-5石英毛細住(30 m×0.25 mm)；程序升溫：柱初溫35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min上升到180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min上升至240 ℃，保持2 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；不分流進樣。

現代社會的競爭是科技、人才的競爭，歸根到底是教育的競爭。傳統的灌輸式教學方式，“你打我通、你說我聽”的教學方法已不適應新形勢的要求。教師對學生的教育作用，已不單單是知識的傳遞，而是教師對學生的思想觀念、文化素養、道德風尚的全面影響。對此，教師要從自身做起，不懈地學習知識，奮力更新觀念，潛心修身養性，以創新為導向，建立前瞻性教育思維，以適應新形勢的發展和要求。

質譜條件：電子轟擊(EI)；電子能量為70 eV；傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z35～400。

1.4 數據處理與統計分析方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行整理統計分析，各項指標結果以“平均數(n=5)±標準偏差”表示，采用S-N-K法進行差異顯著性分析(p<0.05)，圖表中標注不同字母的數據表示數據間具有顯著性差異(p<0.05)；采用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理方式對檸檬酶活的影響

本實驗對檸檬中的酶鈍化條件進行探究， VAMOS-VIGYAZO等[25]發現,POD酶相對于多酚氧化酶(PPO)熱穩定性較強，可作為鈍酶效果指標酶。不同的熱處理方式對檸檬中過氧化物酶(POD)酶活的影響如表1所示。不同方式熱處理，對檸檬中酶活都有一定的影響，且鈍化時間越長，鈍化效果越好。沸水熱燙2 min后，殘留酶活僅剩29.4%，蒸汽處理2 min后，殘留酶活為37.2%。

表1 檸檬中POD酶活分析Table 1 Analysis of POD activity in lemon

注：采用S-N-K法進行差異顯著性分析(p<0.05)，圖表中標注不同字母的數據表示數據間具有顯著性差異(p<0.05)。

2.2 不同熱處理方式對檸檬pH和色澤的影響

檸檬經不同熱處理后，pH及色澤變化如表2所示。經過水浴和蒸汽處理后，檸檬果肉pH值略有降低，因為溫度升高，由水電離出的H+和OH-的濃度都會升高，而pH值是指H+濃度，因此，通過熱處理過的檸檬，pH值會略降低。不同方式熱處理過后檸檬的顏色指標L*、a*、b*值均有不同程度的升高，經過熱燙處理的檸檬，亮度增加，色澤加深，說明熱處理后有更多的色素物質溶出[16]。其中沸水熱燙1.5 min色差ΔE最小。

表2 不同熱燙方式對檸檬pH和色澤的影響Table 2 Effects of different blanching methods on pH and colors of lemon

注：采用S-N-K法進行差異顯著性分析(p<0.05)，圖表中標注不同字母的數據表示數據間具有顯著性差異(p<0.05)。

2.3 不同熱處理方式對檸檬品質的影響

2.3.1 不同熱處理方式對檸檬還原糖含量的影響

檸檬中所含的糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖等。不同熱處理方式對檸檬中還原糖含量的影響如圖1。原檸檬中還原糖含量為41.31 g/kg，經過沸水熱燙1、1.5、2 min后檸檬中還原糖含量分別降低了6.39%、5.23%、3.49%；蒸汽處理1、1.5、2 min后檸檬中還原糖含量有微量增加，分別增加了1.65%、2.83%、3.17%。主要是因為還原糖易溶于水，檸檬中的一部分還原糖會溶解于水中而損失掉；而蒸汽處理，因為檸檬片不與水直接接觸，因此幾乎無溶出損失。

除此之外，檸檬在放置過程中，會發生美拉德反應，產生一些中間產物帶有醛基，在滴定過程中同時被滴定出來；檸檬中含有的部分轉化糖也會在放置過程中，轉化為還原糖。當然，其中不可避免因為檸檬個體不同，其本身的還原糖含量有差異。但大體趨勢如圖1所示。綜上蒸汽處理1 min后對還原糖含量影響最小。

圖1 檸檬中還原糖的含量
Fig.1 The content of reducing sugar in lemon

2.3.2 不同熱處理方式對檸檬丙二醛含量的影響

丙二醛是檸檬中細胞膜質過氧化程度的體現，丙二醛含量高，說明檸檬細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。不同熱處理方式對檸檬中丙二醛含量的影響如圖2，原檸檬中丙二醛含量為0.45 μmol/L，經過蒸汽處理后檸檬中丙二醛含量略有上升，說明其細胞膜經過熱處理時間增加，受到的傷害更嚴重；而經過沸水熱燙1、1.5、2 min后檸檬中丙二醛含量有一定量的降低，分別降低了2.53%、9.54%、24.96%，沸水處理過后檸檬中丙二醛含量顯著降低，是因為丙二醛是一種易溶于水的物質，隨著水浴時間的增加，丙二醛溶出量也增加，因此檢測出檸檬中丙二醛含量反而降低。綜上，蒸汽處理1、1.5 min后對丙二醛含量影響較小。

圖2 檸檬中丙二醛的含量
Fig.2 The content of reducing malonaldehyde in lemon

2.3.3 不同熱處理方式對抗壞血酸含量的影響

不同熱處理方式對檸檬中抗壞血酸含量的影響如圖3，原檸檬中抗壞血酸含量為25.65 μg/mL，經過沸水熱燙1、1.5、2 min后檸檬中抗壞血酸含量分別降低了17.91%、33.92%、34.11%，損失顯著；蒸汽處理1、1.5 min后檸檬中抗壞血酸含量與原檸檬相差不大，蒸汽處理2 min，抗壞血酸含量損失5.95%。主要因為抗壞血酸是一種受熱易分解且易溶于水的物質，抗壞血酸降解有兩個途徑：有氧分解及無氧分解，有氧反應形成脫氫抗壞血酸，再脫水形成2,3-二酮古洛糖酸(DKG)后，脫羧產生酮木塘，最終產生還原酮；無氧分解其主要產物為糠醛，當氧氣完全消耗或者低至某一濃度時便開始進行無氧分解[26]。因此在熱處理過程中，尤其是水浴處理，一部分抗壞血酸會受熱分解或溶于水中，而使得經過熱燙的檸檬中測得的抗壞血酸含量損失顯著。綜上，蒸汽處理1 min、1.5 min后對抗壞血酸含量影響較小。

圖3 檸檬中抗壞血酸的含量
Fig.3 The content of ascorbic acid in lemon

2.3.4 不同熱處理方式對多酚含量的影響

多酚是在檸檬中起到抗氧化的作用，多酚中的酚基結構中的鄰位酚經基很容易被氧化，同時對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力，這使多酚具有了抗氧化線以及清除自由基的能力。不同熱處理方式對檸檬中多酚含量的影響如圖4。

圖4 檸檬中多酚物質的含量
Fig.4 The content of polyphenols in lemon

原檸檬中多酚含量為7.138 mg/kg，經過沸水熱燙1、1.5、2 min、蒸汽處理1、1.5、2 min后，檸檬中多酚含量增加5.23%、3.29%、2.65%、0.28%、9.52%、4.10%。主要是因為在高溫環境中，隨著水分減少，游離酚會通過疏水鍵和多點氫鍵與果肉中蛋白質和糖類發生縮合反應，向結合酚轉化，游離酚含量減少，結合酚含量增加[21]。結合酚含量與還原能力呈正相關，本實驗通過多酚的還原性，將磷鎢鉬酸還原成藍色，通過比色得到酚類物質含量的原理，進行多酚類物質含量的比較。因此經過熱處理的檸檬中所測得的多酚類物質含量有明顯升高。REENA等[27]研究人為熱處理過后總酚含量增加的原因主要是因為熱處理導致了細胞壁的破裂，從而使某些酚類物質溶出，同時某些共軛的酚類物質在熱處理過程中會發生氧化聚合作用，分解使得酚類物質含量增加。

2.4 熱處理方式對檸檬中揮發性香氣成分的影響

不同熱處理方式對檸檬揮發性香氣成分的影響如表3所示。據國外學者分析，檸檬中的檸檬烯、羅勒烯、芳樟醇、香葉醇、香檸檬烯等是檸檬特征香氣成分，水果的芳香物質是果汁等加工品風味的主要構成成分，是評價果實內在品質的重要指標之一，香氣是檸檬果實品質的重要組成部分，體現種類和品種的差異性，香氣成分的研究對提高檸檬品質、育種及其深加工有著重要的意義[20]。

表3 不同熱燙方式對檸檬中揮發性香氣成分的影響Table 3 Effects of different blanching methods on volatile aroma compounds of lemon

注：ND表示沒有檢測到。

醇類和醛類物質是檸檬中揮發性成分的主要組分，包括乙醛、辛醛、芳樟醛、α-松油醇，橙花醇等[28]，這些易揮發的成分經過熱處理后呈現含量增加并且有隨熱燙時間變長而增大的現象，可能是因為檸檬中含有還原糖，加熱促進還原糖與氨基發生反應，產生醛類物質；烯烴類化合物是檸檬之中揮發性成含量最高的一類，包括了α-水芹烯、檸檬烯、羅勒烯、異松油烯等，烯烴類物資經過熱燙處理后的含量變化和醇類和醛類物質含量變化相同，熱處理后含量增加并且有隨熱燙時間變長而增大；酯類和酮類化合物雖然含量較低，但對檸檬的香氣有著一定的貢獻，大多酯類具有特殊的水果香味，本次實驗主要檢測出來的是橙花醇乙酸酯，這類物質經過熱處理后含量要小于原檸檬中的含量，其主要的原因是酯類遇高溫發生了水解反應，含量會有所下降。據統計，在蒸汽處理1.5 min后的檸檬中所含香氣成分與原檸檬香氣成分最接近。

3 結論

本研究以過氧化物酶為酶活檢測物，通過檢測pH和色澤直觀指標，還原糖、抗壞血酸、酚類等營養物質含量，氧化應激標志物丙二醛及揮發性香氣成分等指標，比較選擇出最適宜工業上處理的滅酶條件而抑制檸檬在加工過程中的酶促褐變，得到以下結論：熱處理對檸檬的pH影響不大，但對色澤影響較為明顯，亮度深淺都有變化；蒸汽處理會使還原糖、丙二醛、抗壞血酸以及酚類物質含量略微升高，而沸水水浴處理會使其含量下降，主要是在熱燙過程中溶于水的損失；經過熱燙處理過后，揮發性香氣成分變化明顯，尤其是醇醛類、烯烴類，都有顯著的升高。熱處理方式和處理時間都是影響產品品質的重要因素，熱處理時間越長，酶鈍化效果越好，但檸檬是熱敏性的水果，營養成分和風味穩定性差。

綜合檸檬營養風味成分與酶鈍化程度指標對檸檬產品品質影響，認為選擇蒸汽處理檸檬1.5 min，可以滅掉60%以上的酶活，且還能保持較好的色澤、營養成分及檸檬原有風味。該研究可為檸檬類產品加工生產中褐變問題提供理論參考，特別是在制備檸檬干片、果脯及檸檬茶等檸檬相關產品進行護色處理，對產品褐變有一定的抑制作用。在檸檬其他加工產品上的應用還需要進一步的研究。