二氧化碳浸漬法和傳統(tǒng)法釀造條件下玫瑰香葡萄酒香氣成分的對比分析

李凱,田淑芬，黃建全，商佳胤，黃春芳

(天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，天津，301700)

玫瑰香葡萄(VitisviniferaL. cv. Muscat Hamburg)，也叫麝香葡萄，原產(chǎn)于英國，歐亞種，是著名的鮮食、制汁和釀酒兼用品種，是我國渤海灣地區(qū)主栽品種[1]，由于其香氣濃郁，典型性強，是釀造特色葡萄酒的重要原料。

香氣質(zhì)量是葡萄酒感官質(zhì)量評價中的重要參考因素，香氣成分是構(gòu)成香氣質(zhì)量的重要方面，可以體現(xiàn)葡萄酒典型性和風(fēng)格。重要葡萄酒中檢測到的揮發(fā)性化合物多達(dá)800余種，其中主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、萜類、萜烯類、硫醇類和甲氧基吡嗪類[2]，這些香氣化合物除了來源于葡萄果實[3-4]，還來源于發(fā)酵過程[5-8]和陳釀儲藏過程[9]，因此釀造工藝對葡萄酒香氣成分的組成及含量具有重要影響。目前葡萄酒釀造中使用的方法有連續(xù)發(fā)酵法、旋轉(zhuǎn)罐發(fā)酵法、熱浸漬工藝和CO2浸漬發(fā)酵等，其中CO2浸漬法是將部分破碎或完全不破碎的整粒葡萄漿果置于充滿CO2的密閉容器中，先進(jìn)行厭氧性細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵，之后進(jìn)行酒精發(fā)酵，所釀制的葡萄酒色澤鮮艷，香氣濃郁，且酸度低、成熟快，富有新鮮悅?cè)说墓阄杜c醇美協(xié)調(diào)的酒香味，具有獨特的風(fēng)格[10-11]。

國內(nèi)已有許多研究者采用氣相色譜-質(zhì)譜分析法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析玫瑰香葡萄酒中香氣成分的相對含量[12-14]或絕對含量[15-16]，尚未涉及關(guān)鍵呈香成分的研究，也有研究者分析了兩性花毛葡萄[17]和釀酒品種美樂[18]采用CO2浸漬法釀造后的香氣成分，然而CO2浸漬法對玫瑰香葡萄酒關(guān)鍵香氣成分影響的研究較少。本實驗以天津產(chǎn)區(qū)玫瑰香葡萄酒為研究對象，采用固相微萃取技術(shù)提取葡萄酒香氣成分，用氣相色譜-質(zhì)譜分析法對葡萄酒香氣成分進(jìn)行檢測，利用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法量化分析并結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)[19-20]及氣味活度值(odor activity value,OAV)[21-22]，對比分析CO2浸漬法和傳統(tǒng)法釀造條件下玫瑰香葡萄酒的香氣成分，以便為客觀評價葡萄酒香氣質(zhì)量及優(yōu)化工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒樣

試驗以玫瑰香葡萄為原料，于2016年9月8日采自天津?qū)幒訁^(qū)，可溶性固形物含量為17 Brix°，成熟度一致，無病害。根據(jù)釀造方法將酒樣分為兩組，其中酒樣W1-W9為CO2浸漬法發(fā)酵組(處理組)，考慮到CO2浸漬過程中的破碎程度、CO2浸漬時間和酵母等變量因素，參照正交試驗設(shè)計9個處理，反映不同工藝條件下的CO2浸漬法；W10-W12為傳統(tǒng)法發(fā)酵組(對照組)，不進(jìn)行CO2浸漬，直接進(jìn)行酒精發(fā)酵；試驗主要研究兩組酒樣之間的差異。釀造過程參照李華等人的葡萄酒基本釀造工藝[11]，采用40 L不銹鋼罐進(jìn)行小容器發(fā)酵。按表1所示，采用CO2浸漬法時，將不同程度破碎的葡萄填入預(yù)先充入CO2的發(fā)酵罐中，加入SO260 mg/L，按照浸漬時間要求，進(jìn)行CO2浸漬，浸漬溫度為30 ℃。浸漬完成后出罐，除梗破碎，葡萄醪轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；對照組為酒樣10～12，采用傳統(tǒng)法，不經(jīng)過CO2浸漬，除梗破碎，葡萄醪轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，加入SO260 mg/L。發(fā)酵罐中的葡萄醪均按照30 mg/L的質(zhì)量濃度添加果膠酶，12 h后按照200 mg/L的質(zhì)量濃度添加商業(yè)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蔗糖水在37 ℃下活化 30 min后添加)。待發(fā)酵啟動后，每隔4～6 h測定1次溫度與比重，并壓酒帽，控制發(fā)酵溫度在26 ℃左右。待比重降到 0.992～0.996，并基本維持不變后進(jìn)行皮渣分離。最后向酒樣中加入60 mg/L的SO2，儲藏備用。

表1 CO2浸漬法和傳統(tǒng)法釀造試驗設(shè)計表Table 1 The experiment designs of carbonic macerationmethod and traditional method

1.1.2 儀器與試劑

無水乙醇：色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)樣：β-蒎烯、檸檬烯、異松油烯、(+)-4-蒈烯、里那醇、玫瑰醚、α-松油醇、香茅醇、香葉醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、辛酸甲酯、丁二酸二乙酯、水楊酸甲酯、乙酸辛酯、辛酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、己酸異戊酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸香茅酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸異戊酯、十四酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、苯甲醇、2-苯乙醇、正癸醇、大馬酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-壬酮、2-癸酮、辛酸、苯乙烯、2-辛醇，均購自Sigma-Aldrich公司；氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：5977A-7890B GC-MS聯(lián)用儀(Agilent，美國)；CTC自動進(jìn)樣裝置(Agilent，美國)；萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS型極性(Supelco，美國)；色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25mm×0.25 μm，Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

可溶性固形物、總糖、可滴定酸、揮發(fā)酸、干浸出物、酒精度和pH的測定均參照王華等人[23]的方法。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)分析條件

色譜條件：載氣(高純氦氣)：純度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比為5∶1；升溫程序：35 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至200 ℃，以30 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜檢測條件： 離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子轟擊源70 eV；掃描范圍30～300 amu。

1.2.3 定性定量分析

利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用( HS-SPME-GC-MS)分析方法。

定性分析： 對檢測的揮發(fā)性成分通過未知物分析軟件(美國Agilent 公司)與NIST 11.L譜庫(美國Agilent公司) 提供的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行匹配，如果匹配因子大于80(最高100)，通過相同GC-MS條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和質(zhì)譜圖進(jìn)一步比對確認(rèn)。

定量分析：稱取2.4 g NaCl于20 mL頂空瓶中，然后加入葡萄酒樣8 mL，并加入內(nèi)標(biāo)物2-辛醇8 μL(450 mg/L，無水乙醇稀釋)，頂空瓶加蓋密封后待測。CTC固相微萃取條件：45 ℃預(yù)熱5 min，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為250 r/min(攪拌間歇式運行，轉(zhuǎn)5 s，停2 s)，45 ℃萃取50 min，然后GC進(jìn)樣，250 ℃解吸2 min，采集數(shù)據(jù)。目標(biāo)化合物峰面積積分采用選擇離子模式(SIM)，采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線由5點繪制，由化學(xué)工作站計算定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒基本指標(biāo)

如表2所示，所有酒樣的總糖含量均小于4 g/L，可滴定酸含量在3.88～5.55 g/L之間，揮發(fā)酸含量均低于0.42 g/L，葡萄酒的色度值在0.88～1.89之間，酒體顏色呈淺橙紅色。對于其他指標(biāo)，如干浸出物、酒精度等均符合葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006[24]的要求。

表2 葡萄酒的基本理化指標(biāo)Table 2 The basic physical-chemical indexes of wines

2.2 葡萄酒中香氣定量分析

通過頂空固相微萃取(head space solid phase microextractions，HS-SPME)和GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對材料進(jìn)行香氣成分含量分析，葡萄酒香氣成分含量見表3。

表3 玫瑰香葡萄酒中香氣成分的含量Table 3 The content of aroma components in Muscat Hamburg wines

續(xù)表3

通過定性分析，共檢測出54種香氣成分。按照結(jié)構(gòu)和特性將香氣成分分為6類，分別是萜烯類、酯類、醇類、酮類、脂肪酸類和芳烴類。由圖1可以看出，不同酒樣的總香氣含量方面存在差異，所有酒樣的香氣成分均以醇類和酯類為主，其中醇類含量最高，酯類次之，其余類型含量較低。所有酒樣香氣成分的總含量在117.10～142.40 mg/L，其中萜烯類包括9種香氣成分，總量在649.80～1 617.30 μg/L，該類香氣成分含量較低，僅占總含量的0.55%～1.21%，其中β-蒎烯、里哪醇、香茅醇和香葉醇的含量相對較高(>100 μg/L)。值得注意的是，經(jīng)過CO2浸漬處理的9個酒樣(W1～W9)的萜烯類含量全部高于3個對照組酒樣。酯類香氣成分的種類最豐富，共檢測到30種香氣成分，但含量僅占總含量的25.38%～32.76%，遠(yuǎn)低于醇類；乙酸乙酯含量最高，在24 555.90～27 973.40 μg/L。醇類雖然只有9種香氣成分，但含量最多，占香氣成分總含量的65.27%～72.89%，其中3-甲基-1-丁醇在所有香氣成分中含量最高。此外還檢測出4種酮類成分、1種脂肪酸和1種芳烴，值得關(guān)注的是，在CO2浸漬發(fā)酵的9個酒樣中全部檢測到微量的苯乙烯(6.07～37.73 μg/L)，而傳統(tǒng)發(fā)酵條件的玫瑰香葡萄酒中均未檢測到。

圖1 玫瑰香葡萄酒香氣成分含量比較
Fig.1 Comparison of aroma component content in Muscat Hamburg wines

2.3 香氣含量的主成分分析

主成分分析法利用降維思想，通過研究指標(biāo)體系的內(nèi)在結(jié)構(gòu)關(guān)系，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個相互獨立而且包含原有指標(biāo)大部分信息的綜合指標(biāo)，得到的綜合指標(biāo)(主成分)之間彼此獨立，減少信息的交叉，使得分析評價結(jié)果具有客觀性和準(zhǔn)確性[25]。根據(jù)香氣定量分析結(jié)果，將所有玫瑰香葡萄酒的香氣成分含量構(gòu)成一個12×54的原始數(shù)據(jù)矩陣，然后運用SPSS v 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對54個成分指標(biāo)進(jìn)行處理，最終提取出8個主成分，它們的累計方差貢獻(xiàn)率為96.98%(表4)。

表4 提取8個主成分的方差解釋Table 4 Analysis of variance of 8 principal factors

其中前兩個主成分可以解釋總方差的68.657%，根據(jù)酒樣在前兩個主成分上的分布(圖2-a)，處理組和對照組之間的差異明顯，處理組9個酒樣中的8個均聚集在第一和第二象限聚集，而對照組則全部聚集在第四象限。對于酒樣W9，可能是由于CO2浸漬時原料破碎程度最大(20%)，且浸漬時間最長(15 d)，導(dǎo)致該酒樣與處理組其它8個酒樣之間的香氣成分差異明顯，因此在分析處理組的特征香氣時，以聚集在第一和第二象限的8個酒樣為主。根據(jù)香氣成分在前兩個主成分上的分布(圖2-b)，處理組特征香氣成分包括丙酸乙酯、乙酸丙酯、水楊酸甲酯、乙酸香茅酯、鄰苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇、苯乙烯，這10種香氣成分與處理組8個酒樣在前兩個主成分上的分布特征一致，均與第2主成分呈正相關(guān)，在含量上的表現(xiàn)為處理組濃度普遍高于對照組；而對照組特征香氣成分為乙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕櫚酸乙酯、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮、2-癸酮，這11種香氣成分與對照組的3個酒樣在前兩個主成分上的分布特征一致，均與第1主成分呈正相關(guān)，同時與第2主成分呈負(fù)相關(guān)，在含量上的表現(xiàn)則是對照組濃度顯著高于處理組。然而，香氣成分實際濃度與香氣真正的貢獻(xiàn)率并不成正比，而與其氣味活度值有著直接關(guān)系，氣味活度值也體現(xiàn)出香氣成分的揮發(fā)性大小及難易程度[3]，因此將香氣成分含量與閾值結(jié)合起來分析，更能客觀地認(rèn)識某種香氣成分在葡萄酒香氣中的貢獻(xiàn)。

a-酒樣在前兩個主成分上的分布；b-香氣成分在前兩個主成分上的分布
圖2 酒樣及香氣成分在前兩個主成分上的分布
Fig.2 Loadings of aroma components and of wine samples in the first two PCs

2.4 關(guān)鍵呈香成分分析

根據(jù)香氣值理論，葡萄酒中香氣成分含量高且閾值低的成分很可能是葡萄酒的特征香氣或主體香氣成分[21]。在香氣貢獻(xiàn)中，由于香氣成分之間的相似性，難免有些香氣成分之間充斥著重疊和抑制作用，但對于估計單個香氣成分實際氣味貢獻(xiàn)來說，采用氣味活度值(OAV)來表征葡萄酒中各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻(xiàn)，是目前具有一定參考價值的客觀方法[26-27],當(dāng)OAV大于1時，這種香氣成分對香氣的貢獻(xiàn)和影響較大。根據(jù)OAV值，共確定15種關(guān)鍵呈香香氣成分(見表5)，包括4種萜類、6種酯類、2種醇類、2種酮類和1種脂肪酸，分別是里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香葉醇、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大馬酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸。

表5 葡萄酒中關(guān)鍵呈香成分Table 5 The key aroma components in wines

15種關(guān)鍵呈香成分中辛酸乙酯的OAV值最高，主要貢獻(xiàn)果香和脂肪氣味，其他5種酯類的香氣描述則是菠蘿、蘋果和香蕉等果香，因此酯類主要為玫瑰香葡萄酒提供果香。大馬酮的OAV值僅次于辛酸乙酯，大馬酮屬于C13-降異戊二烯衍生物，被認(rèn)為是潛在影響葡萄和葡萄酒質(zhì)量的芳香化合物，這類化合物主要來自類胡蘿卜素的降解，具有強烈的果香和玫瑰香氣，并且具有極低的香氣閾值(0.05 μg/L)，它們在提高水果香氣特征的同時掩蔽草本香氣[33]。里那醇、玫瑰醚、香茅醇和香葉醇都屬于萜類化合物，萜類化合物主要來源于果實，在葡萄儲藏或發(fā)酵過程中很少或不發(fā)生改變[34]，是形成品種香氣的重要化合物[35]，玫瑰香葡萄獨特的品種香氣玫瑰味就來自于該類化合物，其中玫瑰醚由于其低嗅覺閾值(0.2 μg/L)，是OAV值最高的萜類化合物，在整體香氣中貢獻(xiàn)花香、甜香和玫瑰香味。3-甲基-1-丁醇在所有檢出香氣成分中濃度最高，然而由于其高嗅覺閾值(30 mg/L)，OAV值僅在2.22和2.69之間，乙酸乙酯和2-苯乙醇也同樣如此，這也說明某種香氣成分具有高濃度并不意味著對葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)大，而是與其嗅覺閾值密切相關(guān)。辛酸屬于低級脂肪酸，具有明顯奶酪，并夾帶粗澀的味感，然而對整體酒質(zhì)結(jié)構(gòu)具有重要作用，并且可以抑制芳香酯的水解，因此對于香氣平衡具有重要作用[36]。SHINOHARA[37]研究表明，高含量(>20 mg/L) 的 C6-C10脂肪酸則具有不良風(fēng)味的體現(xiàn)，然而低含量時反而能夠帶來具有愉快的氣味，本研究中辛酸濃度范圍是0.75～1.31 mg/L，可能會給整體香氣帶來愉悅氣味。15種關(guān)鍵呈香成分的氣味描述以令人愉悅的果香和花香為主，同時包括提升香氣復(fù)雜度的蜂蜜、脂肪和奶酪等香氣描述，與感官評價時玫瑰香葡萄酒的香氣特征高度一致，這也證明了玫瑰香葡萄酒的香氣主要來源于這十幾種關(guān)鍵呈香成分。值得我們關(guān)注的是，異丁酸乙酯在處理組中的OAV值均小于1，而在對照組中大于1，因此與傳統(tǒng)工藝相比，CO2浸漬發(fā)酵條件下玫瑰香葡萄酒的關(guān)鍵呈香成分略有減少。

3 結(jié)論

本研究通過HS-SPME和GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析CO2浸漬發(fā)酵對玫瑰香葡萄酒香氣成分的影響，共檢測出54種香氣成分，其中苯乙烯僅在CO2浸漬發(fā)酵的酒樣中檢測到，其余53種香氣成分是所有酒樣的共有香氣成分，包括9種萜烯類、30種酯類、9種醇類、4種酮類和1種脂肪酸類，不同酒樣的總香氣含量略有差異，但均以醇類和酯類為主。

主成分分析結(jié)果顯示，CO2浸漬發(fā)酵與傳統(tǒng)工藝發(fā)酵條件下的酒樣在前兩個主成分上聚集為兩類，存在明顯差異；CO2浸漬發(fā)酵條件下，玫瑰香葡萄酒中丙酸乙酯、乙酸丙酯、水楊酸甲酯、乙酸香茅酯、鄰苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇和苯乙烯的濃度較高；傳統(tǒng)工藝條件下，玫瑰香葡萄酒中的乙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕櫚酸乙酯、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮和2-癸酮的濃度較高。

采用氣味活度值分析關(guān)鍵呈香成分的結(jié)果顯示，傳統(tǒng)工藝條件下玫瑰香葡萄酒中的關(guān)鍵呈香成分有15種，包括里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香葉醇、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大馬酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸；CO2浸漬發(fā)酵條件下玫瑰香葡萄酒中的關(guān)鍵呈香成分減少為14種，不包括異丁酸乙酯。