竹子根際螺旋線蟲中國(guó)新記錄種

王宏洪 申東 黃少彬 卓侃 廖金鈴

摘要 在廣東省園林植物線蟲調(diào)查期間，從粉單竹Bambusa chungii根部土壤中分離到一種螺旋線蟲。經(jīng)詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察和測(cè)量數(shù)據(jù)比較，將其鑒定為尖尾螺旋線蟲Helicotylenchus cuspicaudatus，并獲得了尖尾螺旋線蟲rDNA的28S D2-D3區(qū)和ITS序列，為今后螺旋線蟲的種類鑒定提供了分子數(shù)據(jù)。尖尾螺旋線蟲為中國(guó)新記錄種。

關(guān)鍵詞 粉單竹； 尖尾螺旋線蟲； 形態(tài)學(xué)； 分子特征； 新記錄種

中圖分類號(hào)： S 432.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017492

Abstract A species of spiral nematode was isolated from the rhizosphere soil of Bambusa chungii during the survey of parasitic nematodes associated with landscape plants in Guangdong Province. The detailed morphological study confirmed the species as Helicotylenchus cuspicaudatus. The fragments of rDNA 28S D2-D3 and ITS were amplified and sequenced， which provided molecular characters for rapid and accurate identification of this species in the future. H. cuspicaudatus was reported in China for the first time.

Key words Bambusa chungii； Helicotylenchus cuspicaudatus； morphology； molecular characterization； first-record species

螺旋線蟲屬Helicotylenchus 是Steiner 1945年建立的，該屬大多數(shù)種類是遷移性外寄生線蟲，通過口針刺破根表皮取食；少數(shù)種類是半內(nèi)寄生線蟲，有的種類甚至能夠完全進(jìn)入根內(nèi)生活，造成寄主生長(zhǎng)受阻，并伴隨其他病原物的侵染[12]。螺旋線蟲屬已報(bào)道230個(gè)有效種[3]，其寄主種類多樣，地理分布廣泛[12]。目前中國(guó)報(bào)道的螺旋線蟲有效種約有50個(gè)[4]，其中，雙宮螺旋線蟲H. dihystera （Cobb， 1893） Sher， 1961、雙角螺旋線蟲H. digonicus Perry， 1959、假強(qiáng)壯螺旋線蟲H. pseudorobustus Golden， 1956、多帶螺旋線蟲H. multicinctus （Cobb， 1893） Golden， 1956和刺桐螺旋線蟲H.erythrinae （Zimmermann） Golden， 1956是寄主和分布最廣泛的種類。在2015-2017年間，對(duì)廣東省園林植物的線蟲種類進(jìn)行了調(diào)查，從粉單竹Bambusa chungii McClure根圍土壤中分離到一種螺旋線蟲。通過形態(tài)學(xué)特征觀察、測(cè)量和拍照，以及詳細(xì)的文獻(xiàn)比對(duì)，最終將其鑒定為尖尾螺旋線蟲Helicotylenchus cuspicaudatus，并對(duì)該線蟲的核糖體DNA（rDNA）的28S D2-D3區(qū)和ITS區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，分析了螺旋線蟲屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用土壤取樣器（宏光儀器，型號(hào)：304）分別采集廣東省惠州市國(guó)營(yíng)油田林場(chǎng)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園的粉單竹根圍土壤和根系，取樣深度為5～25 cm，每個(gè)樣品約500 g，裝入自封袋，并分別標(biāo)記為YT07和SCAU。

1.2 線蟲分離、標(biāo)本制作、形態(tài)測(cè)量和拍照

用貝曼漏斗法分離線蟲24～48 h，用膠頭滴管將分離出的線蟲吸入培養(yǎng)皿中觀察。在體視顯微鏡下，用自制線蟲挑針（粘有毛發(fā)的竹簽）將螺旋線蟲挑入裝有清水的指形管中，放入60～65℃水浴中2～3 min殺死線蟲；加入等體積8%甲醛溶液，固定至少24 h；采用甘油酒精法對(duì)線蟲進(jìn)行脫水處理后，制作線蟲玻片標(biāo)本[5]。利用配備尼康數(shù)碼相機(jī)和專業(yè)圖像分析軟件NIS-Elements BR的尼康顯微鏡（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）對(duì)線蟲進(jìn)行形態(tài)測(cè)量和拍照[6]。

1.3 DNA抽提、擴(kuò)增和測(cè)序

利用蛋白酶K法提取單條線蟲DNA，具體方法參照Mundo-Ocampo等[7]。擴(kuò)增rDNA 28S D2-D3區(qū)的引物為D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT-3′）和D3B （5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）[8]，擴(kuò)增ITS區(qū)引物為18S （5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′）和26S （5′TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′）[9]。PCR反應(yīng)體系參照說明書（Ex Taq，TaKaRa，日本）。PCR程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，39個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用EasyPure PCR Purification Kit（全式金生物，北京）切膠回收產(chǎn)物。將純化的YT07群體擴(kuò)增產(chǎn)物直接送至艾基生物技術(shù)（廣州）有限公司測(cè)序，將SCAU群體的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體（PMD-18T vector，TaKaRa，日本），轉(zhuǎn)化DH5α菌株后，挑取陽性克隆送至上述公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列分析軟件Lasergene 7.0 DNAstar拼接編輯后，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫獲取序列號(hào)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank下載螺旋線蟲屬有關(guān)種的28S D2-D3和ITS序列，利用MEGA 6.0 軟件中的 ClustalW 程序進(jìn)行序列比對(duì)，用PAUP 4.0 軟件分析序列比對(duì)文件，用Modeltest 3.7 軟件分析后選擇核酸替代模型，用MrBayes 3.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，Treeview 1.6 軟件打開和編輯系統(tǒng)進(jìn)化樹[6]。基于rDNA 28S D2-D3序列構(gòu)建的螺旋線蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹，外群為塞氏紐帶線蟲Hoplolaimus seinhorsti和Hoplolaimus galeatus[10]；基于 rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，外群為錐尾盤旋線蟲Rotylenchus conicaudatus。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

通過仔細(xì)的形態(tài)特征和測(cè)計(jì)值比較，采自廣東省惠州市國(guó)營(yíng)油田林場(chǎng)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園粉單竹上的螺旋線蟲YT07群體和SCAU群體，均為尖尾螺旋線蟲H.cuspicaudatus Saha， Lal， Singh， Kaushal & Sharma， 2000。形態(tài)測(cè)計(jì)值見表1，表中符號(hào)采用De Man公式。

形態(tài)特征：

雌蟲：蟲體熱殺死后呈閉合的“C”形（圖1a）至螺旋形（圖1b～c）；體環(huán)清晰（圖1d），側(cè)線4條，不具網(wǎng)紋（圖1f～g）；唇區(qū)半球形，前端略平，與體部連續(xù)，唇環(huán)4個(gè)，不清晰（圖1h～k）；口針強(qiáng)壯，口針基部球圓形，前緣平（圖1h、j）至明顯凹陷（圖1i、k）；食道腺背腹覆蓋腸道，腹面覆蓋較長(zhǎng)（圖1d）；排泄孔位于半月體后0～2個(gè)體環(huán)處（圖1d）；雙生殖腺，對(duì)伸，卵母細(xì)胞1～2行排列；受精囊通常不明顯，偶爾能看到中空的方形受精囊（圖1e）；尾圓錐形，腹彎，末端尖（圖1l～m）至細(xì)圓（圖1n～o），腹面14～21個(gè)環(huán)紋（圖1l～n）；側(cè)尾腺孔位于肛門前5～7個(gè)體環(huán)處（圖1o）。

雄蟲：未發(fā)現(xiàn)。

寄主：粉單竹Bambusa chungii McClure。

與原始描述相比，尖尾螺旋線蟲YT07群體排泄孔至體前端距離更短（104.4～109.8 μm vs 115～125 μm），且尾部環(huán)紋數(shù)更少（15～17 vs 19～25），其余形態(tài)特征基本一致。SCAU群體僅排泄孔至體前端距離與原始描述有差異（101～112.2 μm vs 115～125 μm）。YT07群體與SCAU群體相比，僅食道腺與腸瓣膜至體前端的距離略短（98.1～109.5 μm vs 110～121.2 μm），其余形態(tài)特征基本一致。因此，兩個(gè)群體均鑒定為尖尾螺旋線蟲。

尖尾螺旋線蟲的形態(tài)近似種有H. assamensis Saha， Lal， Singh， Kaushal & Sharma， 2000、桑尼螺旋線蟲H. thornei Gupta & Chhabra， 1967和H. shakii Sultan， 1981[11]，其共同特征為：體長(zhǎng)介于500 μm至720 μm之間，c′>1.2，口針長(zhǎng)>24 μm[3]。與H. assamensis相比，尖尾螺旋線蟲的尾部環(huán)紋數(shù)更多（19～25 vs 13～16），唇環(huán)數(shù)更多（4 vs 3）。與桑尼螺旋線蟲相比，尖尾螺旋線蟲有唇環(huán)（vs 無唇環(huán)），雄蟲缺失（vs 存在），側(cè)尾腺孔位于肛門前（vs 位于肛門后）；與H.shakii相比，尖尾螺旋線蟲唇區(qū)為半球形（vs 圓錐形），c′值更大（1.5～2.5 vs 1.2～1.5）。

2.2 分子序列分析

經(jīng)擴(kuò)增和測(cè)序，獲得尖尾螺旋線蟲YT07群體和SCAU群體rDNA 28S D2-D3區(qū)片段長(zhǎng)度分別為656 bp和793 bp，GenBank登錄號(hào)為MG696757（YT07群體）和MG696758-MG696760（SCAU群體）。群體間序列相似性為98.2%～99.1%。BLAST結(jié)果顯示，這兩個(gè)群體與錐尾盤旋線蟲R.conicaudatus的序列相似性最高，為91.7%～92.3%。

擴(kuò)增得到的尖尾螺旋線蟲YT07群體和SCAU群體rDNA-ITS片段長(zhǎng)度分別為1 267 bp和1 378 bp，GenBank登錄號(hào)為MG696761（YT07群體）和MG696762-MG696764（SCAU群體）。群體間序列相似性為97.7%～97.8%。 BLAST結(jié)果顯示，這兩個(gè)群體與多帶螺旋線蟲H. multicinctus的序列相似性最高，為74.8%～76.1%。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

總共有39條序列用于rDNA 28S D2-D3區(qū)序列比對(duì)數(shù)據(jù)集，比對(duì)后的長(zhǎng)度為582 bp，其中保守位點(diǎn)310個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)183個(gè)。圖2為基于rDNA 28S D2-D3 序列在GTR+I+G模型下的貝葉斯一致樹，后驗(yàn)概率（PP）超過50%的數(shù)值顯示在合適的分支上，尖尾螺旋線蟲與錐尾盤旋線蟲、H. brevis （Whitehead， 1958） Fortuner， 1984、Helicotylenchus sp. VII-2和Helicotylenchus sp. VII-3聚為一個(gè)高度支持的分支（PP=95）。rDNA-ITS區(qū)序列比對(duì)數(shù)據(jù)集包含22條序列，比對(duì)后的長(zhǎng)度為1 350 bp，其中保守位點(diǎn)572個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)625個(gè)。圖3為基于rDNA-ITS序列在GTR+I+G模型下的貝葉斯一致樹，后驗(yàn)概率（PP）超過50%的數(shù)值顯示在合適的分支上，除尖尾螺旋線蟲外的所有螺旋線蟲序列以非常高的置信度聚為一支（PP=100），尖尾螺旋線蟲位于螺旋線蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹的基部。

3 結(jié)論與討論

本文將采自廣東省惠州市國(guó)營(yíng)油田林場(chǎng)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園粉單竹根圍的螺旋線蟲均鑒定為尖尾螺旋線蟲，該線蟲為中國(guó)新記錄種。本文首次獲得了尖尾螺旋線蟲的28S rDNA D2-D3區(qū)和rDNA- ITS序列，為今后螺旋線蟲的種類鑒定提供了分子依據(jù)。

由于種間形態(tài)特征覆蓋和種內(nèi)形態(tài)特征多樣性，螺旋線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定十分困難[1]。在原始文獻(xiàn)報(bào)道中[11]，尖尾螺旋線蟲的口針基部球圓，前緣平或略凹陷，尾末端尖，而本研究中兩個(gè)群體口針基部球和尾末端形態(tài)多樣，口針基部球前緣平至明顯凹陷，尾末端尖至細(xì)圓。分子序列分析可以作為螺旋線蟲鑒定的重要輔助手段，許多作者提供了越來越多螺旋線蟲種類的分子序列[1，1012]。然而，由于缺乏地模標(biāo)本的分子數(shù)據(jù)，一些螺旋線蟲種類的分類地位還有待確認(rèn)[10]。

在尖尾螺旋線蟲原始描述文獻(xiàn)中[11]，同時(shí)報(bào)道了另一種與之形態(tài)十分相近的物種—H. assamensis。然而，在本研究中，尖尾螺旋線蟲尾部環(huán)紋數(shù)的變化很大（YT07群體：15～17；SCAU群體：14～21）。YT07群體和SCAU群體的唇環(huán)數(shù)均為4個(gè)。唇環(huán)數(shù)被視為螺旋線蟲鑒定的重要診斷特征，但一些種類的唇環(huán)數(shù)也存在變異[3]。另外，尖尾螺旋線蟲和H. assamensis都是發(fā)現(xiàn)于印度阿薩姆邦Jorhat市的竹子。因此，這兩個(gè)種之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

基于 rDNA 28S D2-D3區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹揭示，尖尾螺旋線蟲與錐尾盤旋線蟲和H. brevis聚在一起。尖尾螺旋線蟲與后兩種線蟲形態(tài)差異明顯。錐尾盤旋線蟲食道腺從背面和側(cè)腹面覆蓋腸，而尖尾螺旋線蟲食道腺背腹覆蓋腸道，腹面覆蓋較長(zhǎng)；H.brevis單卵巢，而尖尾螺旋線蟲雙卵巢。基于rDNA-ITS的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，尖尾螺旋線蟲位于樹的基部，推測(cè)尖尾螺旋線蟲可能是比較原始的種類。尖尾螺旋線蟲與基于rDNA-ITS的系統(tǒng)樹中其他8種螺旋線蟲的重要形態(tài)區(qū)別是c′值更大或尾環(huán)數(shù)更多。雙角螺旋線蟲c′值為0.7～0.9，尾環(huán)數(shù)為4～10；H.broadbalkiensis c′值為0.8～0.9，尾環(huán)數(shù)為15～17；H. microlobus c′為0.9～1.8，尾環(huán)數(shù)為8～13；雙宮螺旋線蟲c′為0.8～1.2，尾環(huán)數(shù)為6～12；假強(qiáng)壯螺旋線蟲c′值為0.9～1.4，尾環(huán)數(shù)為7～12；H. paxilli c′值0.9～1.5，尾環(huán)數(shù)為4～13；刻尾螺旋線蟲c′值為1～1.3，尾環(huán)數(shù)為8；多帶螺旋線蟲c′為0.8～1，尾環(huán)數(shù)為6～12[1011]。

尖尾螺旋線蟲僅在印度的竹子上有報(bào)道[11]，但沒有確定竹子種類，本文明確粉單竹為尖尾螺旋線蟲的寄主。粉單竹是中國(guó)南方特產(chǎn)叢生竹類，在廣東分布比較普遍。粉單竹病蟲害的研究較少[13]，植物線蟲的研究未見報(bào)道。本研究首次報(bào)道了粉單竹根圍的一種螺旋線蟲，其對(duì)粉單竹生長(zhǎng)的危害程度仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）