柑橘黃龍病常規PCR檢測技術研究與初步應用

梁亮 田志清 胡雪芳 張志民 王士奎

摘要 柑橘黃龍病是世界范圍具有毀滅性危害的柑橘細菌性病害，在我國大部分柑橘產區發生，嚴重制約了我國柑橘產業的發展。本文根據黃龍病病原物亞洲韌皮桿菌核糖體16S rRNA基因設計了1對PCR引物HLBF468/HLBR877，并以此為基礎建立了常規PCR反應體系，確定了檢測體系的特異性和靈敏度。結果表明該體系的檢測靈敏度比先前報道的常規PCR方法有了明顯提高。利用建立的PCR體系完成了對廣東和廣西兩省區果園柑橘黃龍病的抽樣檢測。本研究建立的常規PCR方法可以作為一種簡便、準確、靈敏的檢測技術應用于柑橘黃龍病的早期診斷。

關鍵詞 柑橘黃龍病； 亞洲韌皮桿菌； 常規PCR； 靈敏度； 早期診斷

中圖分類號： S 436.66

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017071

Abstract Citrus Huanglongbing （HLB） is a devastating bacterial disease on citrus in the world and seriously restricts the development of citrus industry in our country. Polymerase chain reaction （PCR） approach was established based on a pair of primers， HLBF468/HLBR877， designed from the ribosomal gene sequence of 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus， and its sensitivity was obviously higher than that of the previous reported PCR approach. The samples infected by HLB were collected from Guangdong and Guangxi and were tested by this method. The results showed that this method could be applied for early diagnosis of HLB.

Key words citrus Huanglongbing （HLB）； Candidatus Liberibacter asiaticus； PCR； sensitivity； early diagnosis

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing，HLB）是世界范圍具有毀滅性危害的柑橘細菌性病害，在我國大部分柑橘產區發生，并造成巨大損失，嚴重制約了我國柑橘產業的生存與健康發展[12]。柑橘黃龍病的病原物已于1994年被確定為韌皮部桿菌屬類細菌“Candidatus Liberibacter spp.”，是一種限于篩管組織內寄生的革蘭氏陰性細菌。根據耐熱性和地理分布分為三個種：亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus，非洲種Candidatus Liberibacter africanus和美洲種Candidatus Liberibacter americanus。在我國分布的是亞洲韌皮部桿菌Candidatus Liberibacter asiaticus。柑橘黃龍病的傳播與癥狀表現具有較長的潛伏期（一般為3至8個月），這使得該病的防治和早期診斷工作變得十分困難[35]，為此，建立成本低廉、操作簡便、結果穩定且可靠的快速的柑橘黃龍病早期診斷技術，對于防止柑橘黃龍病進一步擴散傳播，減少果農經濟損失具有重大意義。

PCR檢測靈敏度和可信度高，可批量進行，除了能對顯癥的植物組織中的病原進行定性和定量分析外，還能對未顯癥的植物材料、媒介昆蟲中的病原物進行檢測，目前已成為植物病蟲害診斷的可靠方法之一[4]。近年來，國內外研究人員利用常規PCR檢測方法開展了對柚、柑、橙、橘等果園主要栽培的蕓香科果樹品種的柑橘黃龍病診斷工作，一般情況下可以完成對黃龍病的快速準確檢測[614]。但由于黃龍病病原菌在柑橘植株體內含量較低且分布不均勻，常規PCR檢測結果會出現假陰性，影響了其在黃龍病早期診斷中應用的可靠性。本研究通過設計篩選黃龍病病原物特異性引物對，優化常規PCR體系與反應條件，以提高常規PCR檢測方法的靈敏度，以期為黃龍病早期診斷提供一種簡便可靠的常規PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃龍病陽性樣品：采自廣東康士生物科技股份有限公司江門市新會果園內具有典型黃龍病斑駁癥狀的柑橘樹葉片。

黃龍病陰性樣品：為廣州市齊美植物保護有限公司提供的柑橘脫毒苗葉片。

特異性測試對照樣品：包括筆者從柑橘葉面分離培養的腐生菌，以及由中國農業大學植物保護學院提供的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

空白對照樣品：DNase/RNase-Free去離子水（RT121），購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

在GenBank數據庫中檢索亞洲韌皮部桿菌Candidatus Liberibacter asiaticus及其同屬其他菌種序列長度大于1 000 bp的16S rRNA基因同源序列（GenBank登錄號分別為：DQ432005.1、AB038369.1、AY-919311.1、AJ542545.1、KF926817.1和KT273280.1），對獲得的所有基因片段序列用DNAMAN軟件進行多序列比對，尋找亞洲韌皮部桿菌的保守位點，同時該保守位點又能特異地區分同屬其他種類，在該位點人工設計引物，利用Oligo 7.0軟件對引物進行評估。通過預試驗篩選出最佳引物對HLBF468/HLBR877（HLBF468：5′-GCGATTAAGTTAGAG-GTGA-3′；HLBR877：5′-TACCATCTCTGATAT-CGTCCTATA-3′），預期擴增片段長度為433 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 DNA提取

柑橘葉片組織：分別稱取0.1 g柑橘葉中脈及葉柄置于2.0 mL的離心管中，使用Bullet Blender GOLD24組織細胞破碎儀進行樣品粉碎，然后使用植物基因組DNA提取試劑盒[DP305， 天根生化科技（北京）有限公司]進行基因組DNA提取，具體操作流程參照試劑盒說明書。

菌液：分離培養的柑橘葉面腐生菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，使用細菌基因組DNA提取試劑盒[DP302， 天根生化科技（北京）有限公司]進行基因組DNA提取，具體操作流程參照試劑盒說明書。

1.2.3 PCR擴增和產物測序

使用篩選出的引物對HLBF468/HLBR877進行PCR擴增，通過不斷調整PCR反應試劑用量以及退火溫度、時間等，最終確定PCR反應體系總體積為30 μL，具體包括：2×Taq PCR MasterMix [KT201， 天根生化科技（北京）有限公司] 15.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，ddH2O 11 μL，模板2.0 μL。反應條件為95℃預變性3 min后進行40次PCR循環：95℃變性30 s，55℃退火延伸30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸3 min，PCR產物保存于4℃。擴增反應結束后，取5 μL PCR擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠（已加入SYBGreen熒光染料）上進行電泳檢測，在紫外燈下觀察結果。將出現條帶的PCR產物委托上海生工生物工程有限公司純化并進行雙向測序，返回的測序結果進行BLAST比對，以確定擴增產物是否為目的基因片段。

1.2.4 引物HLBF468/HLBR877的特異性檢測

分別以黃龍病陽性樣品、黃龍病陰性樣品、柑橘葉面腐生菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的DNA為模板，以DNase/RNase-Free去離子水為空白對照，利用引物對HLBF468/HLBR877，按照1.2.3的反應體系進行特異性檢測。

1.2.5 引物對HLBF468/HLBR877的靈敏度檢測

使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[DP210， 天根生化科技（北京）有限公司]回收純化目的條帶，具體操作流程參照說明書。用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測DNA濃度，得到的DNA濃度為11.7 ng/μL，用于后續的靈敏度檢測。

將濃度為11.7 ng/μL的DNA用DNase/RNase-Free去離子水按照10倍梯度依次稀釋為 1.17、0.117、1.17×10-2、1.17×10-3、1.17×10-4、1.17×10-5、1.17×10-6、1.17×10-7、1.17×10-8和1.17×10-9 ng/μL。以每種稀釋液為模板，水為陰性對照，用引物對HLBF468/HLBR877分別對不同濃度的模板DNA按照1.2.3中的反應體系和反應程序進行PCR擴增。

1.2.6 引物對HLBF468/HLBR877與CQULA03F/ CQULA03R[15]的靈敏度對比

胡浩等[15]利用引物對CQULA03F/CQULA03R進行黃龍病常規PCR檢測，該引物對的靈敏度為4.39×10-1 pg/μL，為國內記載的最高靈敏度。將CQULA03F/CQULA03R和本研究篩選出的引物對HLBF468/HLBR877進行靈敏度檢測比較。

按1.2.2的方法提取黃龍病陽性柑橘樹葉片的基因組DNA，并將其按10倍梯度進行稀釋，以各感病葉片組織基因組DNA稀釋液為模板，分別用引物對CQULA03F/CQULA03R按照胡浩等[15]的PCR反應體系和本研究的引物對HLBF468/HLBR877按照1.2.3的PCR反應體系進行擴增。

1.2.7 檢測體系的應用

2016年6月，在廣西恭城陳德全果園選取具有明顯黃龍病紅鼻子果癥狀，已確診感染柑橘黃龍病的2株砂糖橘老樹作為應用效果檢驗的陽性樣本；在廣西恭城新建無黃龍病疫情的金燕子合作社和廣東新會果園，分別選取2株紅心柚樹和1株檸檬樹作為應用效果檢驗的陰性樣本。檢測時分別選取2株感病砂糖橘樹上未表現柑橘黃龍病癥狀的新生葉和其他3株作為陰性樣本的果樹新生葉提取樣本的DNA，然后應用本研究建立的PCR檢測方法進行柑橘黃龍病早期診斷，驗證本研究建立體系的檢測效果。

2 結果與分析

2.1 PCR產物測序與相似性比對結果

委托上海生工生物工程有限公司對預期位置出現特異性條帶的PCR產物進行純化和雙向測序，反饋回來的測序文件經過DNAMAN進行正反向序列拼接后所得序列信息在NCBI上進行BLAST比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）。比對結果顯示擴增片段序列與GenBank中登記的亞洲韌皮部桿菌16S rRNA基因片段（DQ432005.1、AB038369.1、AY919311.1）信息相似度為100%，證明擴增出來的基因片段即為預期擴增的目的基因片段。

2.2 引物對HLBF468/HLBR877的特異性檢測結果

PCR產物經凝膠電泳檢測后黃龍病陽性樣品在433 bp位置出現特異片段；陰性樣品、其他菌種樣品和空白對照未出現該特異片段（圖1），表明設計的引物HLBF468/HLBR877特異性好。

2.3 引物對HLBF468/HLBR877的靈敏度檢測結果

靈敏度檢測結果表明，本研究確定的PCR反應體系可檢測出稀釋108倍的PCR純化產物，即目的片段濃度達到1.17×10-7 ng/μL的情況下，可以檢測出黃龍病陽性樣品（圖2）。

2.4 HLBF468/HLBR877與CQULA03F/CQULA03R[15]的靈敏度對比結果

按照胡浩等[15]的PCR反應體系和本研究確定的PCR反應體系分別進行反應，擴增產物電泳結果見圖3和圖4。結果顯示前者在感病葉片組織基因組DNA稀釋10倍的情況下出現特異性條帶；后者可在感病葉片組織基因組DNA稀釋1 000倍的情況下出現特異性條帶。

2.5 檢測體系應用效果驗證結果

應用本研究建立的柑橘黃龍病檢測方法對廣西恭城、廣東新會等地果園的果樹進行柑橘黃龍病早期診斷。結果如圖5所示，檢測結果與被測5株果樹實際情況一致，初步說明本檢測方法能夠從未表現癥狀的感染黃龍病的果樹的新生葉組織中檢測出柑橘黃龍病病原物，從而實現對柑橘黃龍病的早期診斷和監測預警。同時根據我們的檢測結果建議當地果園負責人及時對感病樹進行防治，防止柑橘黃龍病的傳播蔓延，以減少經濟損失。

3 結論與討論

本研究針對我國柑橘黃龍病，通過對病原物亞洲韌皮桿菌特異性引物的設計篩選、常規PCR反應體系的優化，結合使用適當的植物基因組DNA提取方法，建立了一種能夠高效檢測柑橘黃龍病菌的常規PCR檢測技術體系，為柑橘黃龍病的早期診斷提供了一種簡便、準確、可靠的檢測方法。

PCR技術具有操作簡單、快速、準確、靈敏的特點，在植物病原微生物的檢測鑒定方面已得到廣泛應用。但柑橘黃龍病病原菌主要寄生于寄主植物的維管束細胞中，在寄主體內含量較少且分布不均勻，同時無法通過離體培養的方式進行繁殖，使得提取到的病原微生物DNA太少，造成PCR檢測結果出現假陰性。因此，常規PCR技術的靈敏度高低決定了該方法檢測柑橘黃龍病結果的可靠性，但目前國內多數報道的黃龍病常規PCR檢測技術缺乏靈敏度的檢驗[1618]，本研究設計篩選出的引物對HLBF468/HLBR877對我國柑橘黃龍病病原物亞洲韌皮桿菌具有較高的特異性及更高的靈敏度，檢測靈敏度比國內文獻記載的黃龍病菌常規PCR檢測方法的靈敏度有了明顯的提高。靈敏度的提高將有效避免應用常規PCR檢測出現假陰性的情況，能夠滿足黃龍病早期診斷的需要。

雖然黃龍病的巢式PCR和實時熒光定量PCR檢測方法相較于常規PCR的靈敏度更高[1924]，但是巢式PCR完成一次檢測需要進行兩輪PCR反應，檢測所用時間及成本至少為常規PCR方法的2倍。而實時熒光定量PCR的檢測過程涉及一些較高端的儀器設備，檢測成本也較高，更適合作為監測黃龍病病原物動態變化的研究方法。我們認為基于基因片段序列差異而設計的種特異性引物的常規PCR檢測方法，具有簡便、快速、準確的特點，只要引物設計合理，擴增片段長度適中，就能獲得較好的效果，更適于推廣應用。

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（責任編輯：楊明麗）