低溫對(duì)球孢白僵菌生物學(xué)特性及其對(duì)韭蛆毒力的影響

周仙紅 范曉杰 曹雨 張思聰 莊乾營(yíng) 于毅

摘要 本文室內(nèi)測(cè)試了低溫對(duì)球孢白僵菌高毒力菌株YB8的生物學(xué)特性（菌落生長(zhǎng)速率與產(chǎn)孢量）及其對(duì)韭蛆毒力的影響。結(jié)果表明：在8～25℃溫度范圍內(nèi)菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量隨溫度的降低而降低。在25℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速率為3.15 mm/d，產(chǎn)孢量為5.94×106個(gè)/mm2。20、23℃下菌落生長(zhǎng)速率（1.94、2.91 mm/d）與25℃下相比顯著降低（P<0.05），產(chǎn)孢量（4.80×106、5.57×106個(gè)/mm2）略有降低，差異不顯著（P>0.05），8～17℃下與25℃相比菌落生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量均顯著降低（P<0.05）。低溫下球孢白僵菌對(duì)韭蛆的校正死亡率隨溫度降低而減小，25℃時(shí)韭蛆校正死亡率最高，為45.33%，與其他各溫度差異顯著（P<0.05）。因此低溫對(duì)白僵菌生長(zhǎng)和韭蛆致病力有顯著影響，根據(jù)韭蛆的田間發(fā)生規(guī)律，建議春秋季節(jié)韭蛆盛發(fā)期使用球孢白僵菌防治韭蛆時(shí)應(yīng)在土壤溫度接近或達(dá)到25℃時(shí)使用。

關(guān)鍵詞 球孢白僵菌； 韭蛆； 低溫； 菌落生長(zhǎng)； 毒力

中圖分類號(hào)： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017140

Abstract The effects of low temperature on the biological characteristics （colony growth rate and spore yields） of high-virulence strain Beauveria bassiana YB8 and its toxicity against Bradysia odoriphaga were investigated. The results showed that the colony growth rate and spore yields decreased with decreasing temperature in the range of 8-25℃. The highest colony growth rate （3.15 mm/d） and spore yields （5.94×106 spores/ mm2） were recorded at 25℃. The colony growth rates at 20℃ and 23℃ （1.94， 2.91 mm/d） were significantly lower than that at 25℃ （P<0.05）， while the spore yields （4.80×106， 5.57×106 spores/mm2） had no significant difference from that at 25℃ （P>0.05）. The colony growth rate and spore yields in the range of 8-17℃ were significantly lower than those at 25℃ （P<0.05）. Meanwhile， the toxicity of YB8 to B.odoriphaga decreased with decreasing temperature. The highest mortality （45.33%） was recorded at 25℃， which was significantly higher than those at other temperatures （P<0.05）. Based on the occurrence of B.odoriphaga in the field， it was recommended to use B.bassiana in spring and autumn when the soil temperature was close to or above 25℃.

Key words Beauveria bassiana； Bradysia odoriphaga； low temperature； colony growth； toxicity

韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang，屬于雙翅目，長(zhǎng)角亞目，眼蕈蚊科，遲眼蕈蚊屬，是蔥蒜類蔬菜的重要害蟲，幼蟲俗稱韭蛆，喜食韭菜根部。韭菜遲眼蕈蚊在田間以幼蟲（韭蛆）為害，春季主要為害植株葉鞘、幼莖和芽，引起幼莖腐爛、葉片枯黃，而后把莖咬斷并蛀入莖內(nèi)。夏季氣溫較高，幼蟲向下活動(dòng)，深入鱗莖，造成鱗莖腐爛引起整株死亡。冬季氣溫低，韭菜遲眼蕈蚊以老熟幼蟲越冬[1]。環(huán)境，如溫度、濕度、降水、寄主植物的品種及覆蓋面積是影響昆蟲發(fā)生發(fā)展的主要因素，其中溫度和濕度對(duì)韭菜遲眼蕈蚊影響較大，適度低溫和高濕對(duì)其生存有利，而過(guò)高溫度和濕度或低溫、低濕可降低其存活率[2]。馮惠琴等[3]、梅增霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)20～25℃下韭菜遲眼蕈蚊的種群增長(zhǎng)指數(shù)和繁殖力較高，說(shuō)明該溫度范圍是韭菜遲眼蕈蚊的適宜生長(zhǎng)溫度，這就是該蟲春、秋季發(fā)生重的原因之一。

球孢白僵菌Beauveria bassiana屬于絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，白僵菌屬，是一種能寄生15目149科700多種昆蟲和蜱螨類的廣譜性的昆蟲病原真菌[5]，因此其被公認(rèn)為目前世界上防治害蟲應(yīng)用較廣、最有前途的一種蟲生真菌[6]。蟲生真菌在其生產(chǎn)過(guò)程和田間應(yīng)用中會(huì)受到溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響[7]，溫度影響球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢繁殖各個(gè)生長(zhǎng)階段。球孢白僵菌孢子萌發(fā)的溫度范圍為5～35℃[89]，生長(zhǎng)速度一般隨溫度的升高而加快，溫度過(guò)低對(duì)球孢白僵菌的產(chǎn)孢量影響不大，但容易造成孢子萌發(fā)時(shí)間推遲、菌絲生長(zhǎng)稀疏[1011]。室內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，適宜球孢白僵菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的溫度，也是防治害蟲的最佳溫度，低溫（17℃以下）或高溫時(shí)（29℃以上）會(huì)抑制球孢白僵菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致其殺蟲效果顯著降低[1216]。由于春、秋季是韭蛆為害高峰期，而夏季幾乎不發(fā)生，因此本文選取實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的對(duì)韭蛆致病力強(qiáng)的球孢白僵菌菌株YB8，研究低溫對(duì)球孢白僵菌生物學(xué)特性的影響，同時(shí)室內(nèi)測(cè)定了低溫下YB8對(duì)韭蛆的毒力，旨在為指導(dǎo)田間使用球孢白僵菌防治韭蛆的溫度范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：球孢白僵菌Beauveria bassiana自亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis上分離獲得，經(jīng)篩選后獲得對(duì)韭蛆高毒力菌株YB8。菌株保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所4℃冰箱中。使用前用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）在恒溫箱中培養(yǎng)形成菌落，培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光周期L∥D=0 h∥24 h。

供試?yán)ハx：韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang采自山東壽光韭菜田，并于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)用人工飼料[17]連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度70%±5%。試驗(yàn)選用健康活潑的3齡幼蟲。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫對(duì)球孢白僵菌菌株YB8的菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響

將球孢白僵菌在PDA培養(yǎng)基上活化10 d左右，用直徑5 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA平板中央，分別置于不同溫度（8、11、14、17、20、23和25℃）恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。采用十字交叉法[12]測(cè)量菌落直徑，每24 h測(cè)定1次，共測(cè)量10 d，計(jì)算菌落生長(zhǎng)速率。10 d后用直徑5 mm的滅菌打孔器從菌落中心距離邊緣1/2處打取菌餅，每個(gè)處理取3個(gè)菌餅，接入15 mL 含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水中，攪拌使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，并計(jì)算出每平方毫米的產(chǎn)孢量。

菌落增長(zhǎng)直徑（mm）=菌落直徑-菌餅直徑（5 mm）；

菌落生長(zhǎng)速率（mm/d）=菌落增長(zhǎng)直徑/培養(yǎng)時(shí)間（10 d）；

產(chǎn)孢量（個(gè)/mm2）=孢子數(shù)/（mL）×15/（π×半徑2）

1.2.2 低溫下球孢白僵菌YB8對(duì)韭蛆的毒力測(cè)定

將韭菜假莖剪成1 cm小段放入1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液中浸泡5 min后放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底層用瓊脂和濾紙進(jìn)行保濕，在濾紙上滴加600 μL 1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，每皿接入30頭健康、活潑的韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，每處理重復(fù)5次，同時(shí)設(shè)無(wú)菌水對(duì)照。分別放入8、11、14、17、20、23和25℃，RH =70%±5%，全黑暗恒溫箱中飼養(yǎng)，11 d后記錄死亡蟲數(shù)，計(jì)算校正死亡率，并收集活蟲。以毛筆尖輕觸蟲體，幼蟲不動(dòng)或身體明顯收縮為死亡，記錄死亡蟲數(shù)并計(jì)算校正死亡率。

校正死亡率=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)不同處理間的差異進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukeys-b（K）氏多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)球孢白僵菌菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響

以25℃作為對(duì)照溫度，研究低溫對(duì)球孢白僵菌生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響。表1數(shù)據(jù)結(jié)果表明：7個(gè)溫度下球孢白僵菌均能生長(zhǎng)。25℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速率達(dá)到最高，為3.15 mm/d，10 d菌落直徑擴(kuò)展了31.5 mm。球孢白僵菌菌落生長(zhǎng)速率隨溫度的降低而明顯降低（F=206.901，df=6，P=0.000）。8℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速率最低，為0.19 mm/d。球孢白僵菌的產(chǎn)孢量隨溫度的降低而減少，25℃、23℃時(shí)與20℃時(shí)的產(chǎn)孢量分別為5.94×106、5.57×106、4.80×106個(gè)/mm2，且三者相比差異不顯著（F=11.617，df=6，P=0.176），8～17℃產(chǎn)孢量與25℃相比明顯減少（F=11.617，df=6，P=0.000），其中8℃產(chǎn)孢量最低，為0.89×106個(gè)/mm2。因此在供試溫度范圍內(nèi)，25℃相比其他溫度最適合球孢白僵菌YB8的生長(zhǎng)。

2.2 低溫下球孢白僵菌對(duì)韭蛆的毒力

表2試驗(yàn)結(jié)果表明，接種球孢白僵菌后韭蛆校正死亡率隨溫度的降低而明顯降低。

25℃時(shí)接種后11 d韭蛆校正死亡率達(dá)到最高，為45.33%，與其他溫度差異顯著（F=214.652，df=6，P=0.000），8、11及14℃下接種后11 d韭蛆校正死亡率為0，而20℃和23℃時(shí)韭蛆校正死亡率分別為24.67%、29.33%，兩者之間差異不顯著（F=214.652，df=6，P=0.678）。因此在供試溫度范圍內(nèi)，25℃相比其他溫度球孢白僵菌對(duì)韭蛆致病力更強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于白僵菌對(duì)昆蟲的毒力研究較多的有蚜蟲、粉虱、菜粉蝶、玉米螟等[18]。已有的研究表明，白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期（如菌絲生長(zhǎng)期和產(chǎn)孢期）的最適溫度不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，供試溫度范圍內(nèi)最適合球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育的溫度為25℃，從最低生長(zhǎng)溫度開始，隨著溫度的升高生長(zhǎng)速度提高，產(chǎn)孢量增加，這與前人的研究結(jié)果基本一致[7，1213，19]。在一定的溫度范圍內(nèi)，白僵菌的侵染力隨溫度升高而增強(qiáng)[20]，這與本文中25℃時(shí)白僵菌孢子萌發(fā)率最高、萌發(fā)速度最快及對(duì)韭蛆的毒力最強(qiáng)的結(jié)果一致。

根據(jù)韭蛆的田間發(fā)生規(guī)律[3]以及白僵菌對(duì)低齡韭蛆毒力更高這一特點(diǎn)，田間可在春季和秋季韭蛆低齡幼蟲[21]時(shí)期使用白僵菌，此時(shí)山東地區(qū)土壤5 cm深度周平均溫度為18.5～22.8℃[22]。由于20～23℃下球孢白僵菌對(duì)韭蛆的致死率較低，可以加大白僵菌的使用量，這樣既保證了白僵菌的最優(yōu)生長(zhǎng)條件，又提高了防治效果。雖然低溫下白僵菌對(duì)當(dāng)代韭蛆的毒力較低，但白僵菌孢子在韭蛆體內(nèi)仍能繁殖、累積，并能垂直傳播到下一代[2324]，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)控制害蟲的目標(biāo)，白僵菌對(duì)下一代韭蛆的影響有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊集昆，張學(xué)敏.韭菜蛆的鑒定遲眼蕈蚊屬二新種（雙翅目：眼蕈蚊科）[J].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1985，11（2）：153156.

[2] 李文香，楊玉婷，吳青君，等.韭菜遲眼蕈蚊研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2015，41（5）：812.

[3] 馮惠琴，鄭方強(qiáng).韭蛆發(fā)生規(guī)律及防治研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，18（1）：7180.

[4] 梅增霞，吳青君，張友軍，等.韭菜遲眼蕈蚊的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)及其防治[J].昆蟲知識(shí)，2003，40（5）：396398.

[5] 翟錦彬，黃秀梨，許萍.殺蟲真菌——球孢白僵菌的昆蟲致病機(jī)理研究近況[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（1）：4548.

[6] 顧麗嬙，李春香，張淑紅.球孢白僵菌和布氏白僵菌對(duì)甜菜夜蛾的室內(nèi)毒力測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：118120.

[7] 蒲蟄龍，李增智.昆蟲真菌學(xué)[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[8] ISKANDAROV U S， GUZALOVA A G， DAVRANOV K D.Effects of nutrient medium composition and temperature on the germination of conidia and the entomopathogenic activity of the fungi[J].Prikladnaia Biokhimiia Mikrobiologiia，2006，42（1）：8185.

[9] 林華峰，樊美珍，李增智.不同溫濕度下白僵菌對(duì)松毛蟲的侵染致病效應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1998，9（2）：195200.

[10]原貴生，謝映平，牛宇，等.白僵菌對(duì)山西林區(qū)油松毛蟲的致病效果[J].中國(guó)生物防治，2006，22（2）：118122.

[11]武覲文.微生物殺蟲劑的應(yīng)用[M]∥陳昌潔.松毛蟲綜合管理.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1990：256273.

[12]鄺灼彬，呂利華，馮夏，等.溫度及常見(jiàn)農(nóng)藥對(duì)球孢白僵菌生物學(xué)特性的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（3）：2629.

[13]孫魯娟，吳孔明，郭予元.不同溫、濕度下白僵菌對(duì)棉鈴蟲幼蟲的致病力[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2001，44（4）：501506.

[14]何余容，呂利華，鄺灼彬，等.不同溫濕度下球孢白僵菌對(duì)小猿葉甲的致病力[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48（5）：679686.

[15]DAL BELLO G， PADIN S， JUAREZ P， et al. Biocontrol of Acanthoscelides obtectus and Sitophilus oryzae with diatomaceous earth and Beauveria bassiana on stored grains[J]. Biocontrol Science and Technology，2006，16（1/2）：215220.

[16]VASSILAKOS T N， ATHANASSIOU C G， KAVALLIERATOS N G， et al. Influence of temperature on the insecticidal effect of Beauveria bassiana in combination with diatomaceous earth against Rhyzopertha dominica and Sitophilus oryzae on stored wheat [J].Biological Control，2006，38（2）：270281.

[17]周仙紅，張思聰，莊乾營(yíng)，等.韭蛆人工飼料配方篩選及飼養(yǎng)效果比較[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2015，58（11）：12451252.

[18]曹衛(wèi)平，馮書亮，王金耀，等.白僵菌防治刺吸式口器害蟲研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)生物防治，2006，22（2）：129134.

[19]李榮森，羅紹彬.微生物防治害蟲[M].北京：科學(xué)出版社，1983：2745.

[20]李春香，張淑紅.白僵菌對(duì)害蟲致病性的研究進(jìn)展[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，27（5）：4043.

[21]陳浩，王玉濤，高歡歡，等.韭菜遲眼蕈蚊生物防治研究現(xiàn)狀與展望[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（3）：158161.

[22]周仙紅，翟一凡，沈一凡，等. 不同栽培模式韭菜田韭菜遲眼蕈蚊和蔥黃寡毛跳甲的種群動(dòng)態(tài)[J].植物保護(hù)，2016，42（3）： 215221.

[23]林華峰，李增智，胡萃.不同環(huán)境中松毛蟲感染白僵菌過(guò)程的組織病理變化[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，25（4）：330335.

[24]QUESADA M E， YOUSEF M， ESTEVEZ A， et al. Beauveria bassiana （Ascomycota： Hypocreales） wound dressing for the control of Euzophera pinguis （Lepidoptera： Pyralidae）[J]. Journal of Economic Entomology，2013，106：16021607.

（責(zé)任編輯：楊明麗）