一種新的豇豆根腐病病原菌鑒定及室內藥劑篩選

張河慶 席亞東 陳玲 向娟 韓帥 吳婕

摘要 本文對四川成都發生的豇豆根腐病病原菌進行鑒定，為豇豆根腐病的藥劑防治提供依據。采集了成都市豇豆種植區豇豆根腐病病株，經常規組織分離并純化獲得116株分離菌株，對分離菌株進行致病性測定、形態學鑒定及rDNA-ITS序列分析。結果表明，分離到的鐮孢菌中有10株為Fusarium commune，分離頻率為8.62%。對該10株菌進行致病性測定，均為致病菌株；其中MW4-11菌株致病性最強。該致病菌株的最適生長溫度為25～30℃，菌絲致死溫度為70℃。選用7種殺菌劑通過平皿培養法對MW4-11菌株進行室內毒力測定。結果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對該致病菌株的毒性最強，EC50為0.030 μg/mL。

關鍵詞 豇豆； 根腐??； 鐮孢菌； Fusarium commune

中圖分類號： S 436.43

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017221

Abstract This paper aims to identify the pathogen of cowpea root rot， and provide reference for the control of the disease. Totally 116 isolates collected from diseased plants in Chengdu City were identified based on pathogenicity test， morphological characteristics and ITS rDNA sequence analysis. Of which 10 isolates belong to Fusarium commune， accounting for 8.62%. Pathogenicity assays indicated that these Fusarium commune isolates were pathogenic to cowpea， and the most pathogenic strain was MW4-11. The mycelial growth test on MW4-11 indicated that the optimal temperature range for the mycelial growth was 25-30℃ and the lethal temperature was 70℃. Toxicities of 7 fungicides were tested by petri dish cultivation method. The results showed that trifloxystrobin · tebuconazole 75% WG had the highest toxicity to F.commune MW4-11， with the EC50 values of 0.030 μg/mL.

Key words cowpea； root rot； Fusarium； Fusarium commune

豇豆Vigna unguiculata （L.） Walp.是我國普遍栽培的蔬菜之一，全國常年栽培面積在33萬hm2以上，四川省栽培面積在1萬hm2以上[1]。豇豆鐮孢型根腐病是重要的土傳病害之一，在我國豇豆產區普遍發生，田間病株率為10%～100%。在田間可以與絲核菌根腐病、疫霉根腐病等形成病害復合體，造成更大的危害[2]。

豇豆根腐有鐮孢型根腐、疫霉型根腐、腐霉型根腐、絲核菌型根腐等。吳仁峰等分離鑒定湖北武漢地區豇豆根腐病原菌為茄鐮孢Fusarium solani[3]；楊玉潔等人認為江蘇省如皋市豇豆根腐病原菌主要有茄鐮孢F.solani、尖鐮孢F.oxysporum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[4]；幾內亞、印度、中非、尼日利亞等地的豇豆根腐病病原菌為瓜果腐霉Pythium aphanidermatum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[58]；印度豇豆根腐病病原菌主要為菜豆殼球孢菌Macrophomina phaseolina[9]。目前，還未見Fusarium commune侵染豇豆引起根腐病的報道。鐮孢菌能夠以厚垣孢子的形式在土壤中存活10年以上，在離開寄主的情況下也能存活5～6年[10]。因此，對該病的防治非常困難。

本研究對引起成都地區豇豆根腐病的病原菌進行分離鑒定，以明確引起成都豇豆根腐病的病原種類，并針對該病菌進行室內防治藥劑篩選，旨在為成都地區豇豆根腐病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源與病原菌的分離純化

病樣于2016年采自成都市的豇豆主產區。病原真菌的分離方法參照方中達[11]的《植病研究方法》。選取新發病豇豆植株莖基部的根莖作為分離材料，進行常規組織分離，經單孢純化、培養獲得單孢菌株，并于4℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養基上保存。

1.2 致病性測定

采用Kochs Rules進行分離菌株的致病性測定。將分離到的菌株用PDA培養基活化，培養5 d后轉接到馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）中，于28℃，160 r/min搖床上培養3～5 d，然后將病菌純培養物（孢子）制成濃度為106～107個/mL懸浮液。采用自然傷根浸根法接種。取生長良好的無病‘贛蔬領袖豇豆苗（江西金浩種業有限公司生產），用清水將根部表面沖洗干凈后將根部完全浸在孢子懸浮液中30 min，接種后的植株定植于裝有無菌泥炭土的營養杯中。每個菌株接種10株苗，以清水為對照。植株置于25℃下植物培養箱中，接種后每隔1～2 d觀察1次。發病后，從病斑處再次分離病原菌，確認致病菌。

接種15 d后調查豇豆的發病率和病情指數，所得數據用Excel進行匯總，利用SPSS 16.0軟件的Duncan法進行差異顯著性分析。根據發病率和病情指數挑選致病性強的菌株進行后續試驗。

豇豆根腐病分級方法參照國家標準GB/T17980.882004農藥田間藥效試驗準則（二）第88部分《殺菌劑防治大豆根腐病》。

0：植株莖基部和主根均無病斑；

1：莖基部和主根上有少量病斑；

3：莖基部和主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1/4～1/2；

5：莖基部及主根上病斑多且大，病斑面積占莖基部和根部總面積的1/2以上～3/4；

7：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現象，但根系并未死亡；

9：根系壞死，植株地上部分萎蔫或死亡。

病情指數=∑（各級發病株數×該級代表值）×100/（調查總株數×病情最高級代表值）；

發病率=（發病株數/總株數）×100%。

1.3 病原菌形態學鑒定

將供試的致病菌株接種到PDA培養基上，25℃恒溫黑暗培養，72 h后使用十字交叉法測定菌落的生長速率。7 d后觀察培養基上的菌落形態特征。在SNA培養基上觀察分生孢子梗、大小分生孢子和厚垣孢子的特征，并隨機測量20個分生孢子的大小。

根據菌落形態、生長速度和色素顏色，大、小型分生孢子的特征，厚垣孢子有無和著生位置等特征，參照Skovgaard等的報道[12]，并結合Leslie等[13]的鐮孢菌實驗室手冊進行病原菌種的形態學鑒定。

1.4 溫度對致病菌株生長的影響

選取致病性強的菌株MW4-11于PDA培養基上25℃培養5 d，用7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種在PDA培養基上，分別置于5、10、15、20、25、30 、35和40℃培養箱中培養3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復4次。

1.5 菌絲致死溫度測定

選取致病性強的菌株MW4-11于PDA培養基上25℃培養5 d，用7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊并置于無菌試管中，加入2 mL無菌水。分別在35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴鍋中處理10 min 后取出迅速冷卻，將菌絲塊取出置于PDA平板上25℃恒溫培養，5 d后觀察菌絲生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復4次。

1.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系統發育分析

1.6.1 菌絲制備

將保存的菌株接種到PDA培養基上，每皿接種一個菌絲塊，于25℃暗培養7 d后用滅菌的載玻片刮取菌絲，并用液氮冷凍研磨成粉，置于-80℃保存，用于基因組DNA提取。

1.6.2 基因組DNA提取

基因組DNA采用改良的CTAB法提取[14]，然后用核糖體內轉錄間隔區（rDNA-ITS）的通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCC-TCCGCTTATTGATATGC進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所得擴增產物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序，得到ITS序列，所得序列在GenBank數據庫中通過BLAST功能搜索相似度較高的ITS序列。選擇測序獲得的序列以及GenBank數據庫中相關序列，運行Clustal W程序進行序列比對。再運用軟件MEGA 6.0，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建系統發育樹。

1.7 不同殺菌劑對豇豆根腐病病原菌的室內毒力

1.7.1 供試藥劑

75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑，德國拜耳作物科學公司；50%醚菌酯水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；50% 烯酰嗎啉水分散粒劑，北京達世豐生物科技有限公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；22.5%啶氧菌酯懸浮劑，美國杜邦公司；100 g/L氰霜唑懸浮劑，日本石原產業株式會社；30%噁霉靈水劑，四川國光農化股份有限公司。

1.7.2 含藥平板制備

各供試藥劑的濃度梯度見表1。濃度1為廠家推薦濃度。先將供試藥劑稀釋成相應系列濃度的10倍，然后按藥液與培養基1∶9的比例，將藥液加入到熔化的培養基中，制成含藥平板，每個濃度設置4個重復。

1.7.3 測定方法

用打孔器在培養5 d的病原菌菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，分別放在不同藥劑平板中央，菌絲面朝下，以加入等量無菌水的培養基作為空白對照；在25℃的恒溫培養箱中倒置培養，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算殺菌劑對菌絲生長的抑制率，并用DPS數據分析軟件求EC50，比較供試藥劑的毒力大小。

抑制率=（空白對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（空白對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與培養

從采自成都市豇豆產區的豇豆根腐病樣品中共分離到116株鐮孢菌，其中有10株初步定為F.commune （菌株編號為：MW4-11，MW4-12， MW1-12，MS1-31，MS1-32，CY28411，CY28412，CY28413，PZ10.11，PZ10.12），分離頻率為8.62%。

2.2 致病性測定

用2.1初步確定的10株F.commune的分生孢子懸浮液接種自然傷根的豇豆植株，結果表明，接種后豇豆植株均能發病。發病初期，植株葉片沒有明顯變化，植株生長緩慢；發病中期植株出現倒伏萎蔫，葉脈黃化，拔出植株，可見其根部自根尖開始發生病變，由側根延及主根，致整個根系壞死腐爛，并可延及根莖部，對照均不發病（圖1）。從病斑處再次分離得到的菌株其性狀均與原菌株相同。致病性測定表明（表2）10株F.commune均為致病病原菌，其中MW4-11菌株接種后植株易發病，致病性最強，植株發病率為100%，病情指數為84.57±0.62，顯著高于其他分離菌株，因此選取MW4-11菌株作為后續試驗菌株。

2.3 病原菌形態特征

選取致病性最強的菌株MW4-11在PDA培養基上培養，25℃恒溫黑暗培養72 h菌落直徑為4.3 cm。菌落生長較快，氣生菌絲發達，為白色絨毛狀，培養基背面的色素從無色到乳白色，之后顏色隨培養時間的延長變為淡黃色，（圖2a～b）。在SNA培養基上，小型分生孢子數量較多，橢圓形至棍棒形，通常無隔膜，大小為（3.5～10.1）μm×（2.2～3.5）μm（圖2c）；大型分生孢子較少，細長，梭形兩端略彎，有1～3個分隔，3個分隔居多，頂細胞彎曲或收縮變尖，足細胞足形或收縮呈點，大?。?2.1～39）μm×（3.5～3.8）μm（圖2d）；產孢細胞為短單瓶梗（圖2f），偶有較長的單瓶梗（圖2e）；厚垣孢子單生（圖2g）。參照Skovgaard等[12]的報道，結合Leslie等[13]的分類系統，將該菌鑒定為Fusarium commune。

2.4 溫度對MW4-11菌株生長的影響

圖3為MW4-11致病菌株在不同溫度條件下培養3 d的生長情況，表明菌絲最適生長溫度為20～25℃；在10～35℃條件下均可生長，在5℃和40℃條件下幾乎不能生長。

2.5 MW4-11致病菌株的致死溫度

由菌絲致死溫度的測定結果（圖4）可知，菌落直徑隨處理溫度升高有降低趨勢。65℃及以下水浴處理10 min后的菌絲均能在PDA培養基上再生長，而70℃水浴處理10 min后所有重復處理均無菌絲生長。說明MW4-11菌株致死溫度為70℃（10 min）。

2.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系統發育分析

在形態學上，Skovgaard等和Yu等認為Fusarium commune與尖鐮孢非常相似很難區分，需用分子生物學技術進行鑒定[12，15]。本文以ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）與ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物對10株病原菌的ITS區進行擴增，并對ITS區進行雙向測序，測序結果與GenBank中核酸數據庫進行同源性比較，結果顯示10株病原菌的ITS序列與GenBank中的Fusarium commune （GenBank登錄號為：KU341323.1， KT98228.1， KU341323.1）的相應片段相似度均達到99%以上，E-value值為0.0。運用MEGA 6.0軟件，根據Kimura2-parameter模型，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建系統發育樹（圖5），bootstrap自展重復1 000次計算系統樹種的置信度。結果顯示，10株病原菌與F.commune在同一分支上，因此將該10株病原菌鑒定為F.commune。

2.7 殺菌劑毒力測定結果

選取致病性最強的Fusarium commune菌株MW4-11測定供試殺菌劑對其的毒力。據試驗結果（表3）可知，7種殺菌劑對MW4-11菌株均有抑制作用。其中75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑的抑菌效果最好，最高濃度下抑制率為94.55%，EC50為0.030 μg/mL；30%噁霉靈水劑、16%二氰·吡唑酯水分散粒劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑和50%烯酰嗎啉水分散粒劑的抑菌效果次之，最高濃度下抑制率分別為83.21%、80.9%、71.18%、67.99%，EC50分別為19.498、69.158、24.805、79.549 μg/mL； 100 g/L氰霜唑懸浮劑和50%醚菌酯水分散粒劑的抑菌效果差，50%醚菌酯水分散粒劑最高濃度下抑制率僅為49.92%，且EC50高達211.170 μg/mL；雖然100 g/L氰霜唑懸浮劑在最高濃度下抑制率較高，但EC50也最大，為2 059.054 μg/mL。

3 討論

形態學鑒定和分子鑒定結果表明，分離到的116株鐮孢菌中，有10株為Fusarium commune，分離頻率為8.62%。致病力測定結果表明，接種MW4-11菌株的豇豆發病率為100%，病情指數為84.57±0.62， MW4-11菌株屬于強致病菌。

已有研究表明，鐮孢屬真菌是引起豇豆根腐病的重要病原菌，其中茄鐮孢被認為是豇豆鐮孢型根腐的主要病原菌[3，16]，Shrestha等報道層生鐮孢也可以引起豇豆根腐[17]；而本研究發現Fusarium commune對豇豆有強的致病力，也能夠引發豇豆根腐病。

2003年Skovgaard等首次將Fusarium commune作為一個新種來描述，F.commune的形態特征與F.oxysporum非常相似，而且該菌在2003年之前一直被鑒定為F.oxysporum。這兩種菌都能從短的單瓶梗上產生分生孢子，且厚垣孢子為單生或對生。唯一能夠區分這兩種菌的形態特征是F.commune存在細長的單瓶梗，偶爾會出現多瓶梗[12]。據報道，F.commune能夠引起美國白松、黃杉、康乃馨、玉米、胡蘿卜、大麥和山葵根腐病[12，15]，也能夠引起番茄的冠腐病和根腐病[18]。Fusarium commune作為豇豆根腐病的病原菌是首次報道。

本試驗對引起豇豆根腐病的病原菌MW4-11菌株進行最適生長溫度和致死溫度的研究，結果表明，該菌最適生長溫度為20～25℃，在5℃以下、40℃以上幾乎不生長，該菌生長規律與尖鐮孢大體一致[19]。該菌菌絲致死溫度為70℃（10 min），鄭莉等報道草莓枯萎病菌Fusarium oxysporum Schl.菌絲生長的致死溫度為65℃（10 min）[20]，賀春萍等研究發現，西瓜尖鐮孢Fusarium oxysporum f.sp.niveum（E. F Smith）Snyder & Hansen菌絲的致死溫度為80℃（10 min）[21]。說明Fusarium commune 與尖鐮孢以及尖鐮孢不同?；椭g菌絲生長對溫度的敏感性存在差異。

為了篩選抑制Fusarium commune生長的化學藥劑，為防治Fusarium commune引起的根腐病提供依據，我們測定了7種殺菌劑對MW4-11菌株的室內毒力，結果（表3）表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對該病菌菌絲生長的抑菌效果最好，最高濃度下抑制率為94.55%，EC50為0.030 μg/mL，其次為30%噁霉靈水劑、16%二氰·吡唑酯水分散粒劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%烯酰嗎啉水分散粒劑，它們均可作為豇豆根腐病防治的候選藥劑。豇豆根腐病的傳統防治藥劑為噁霉靈，而本研究結果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對豇豆根腐病病原菌的生長抑制效果好于30%噁霉靈水劑；22.5%啶氧菌酯懸浮劑對豇豆根腐病病原菌的生長抑制效果與30%噁霉靈水劑的相當。本研究拓寬了防治豇豆根腐病的藥劑選擇范圍，為豇豆根腐病的防治提供了科學依據。

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（責任編輯：楊明麗）