獼猴桃青霉病病原菌鑒定及中草藥提取物對其抑菌效果

程小梅　彭亞軍　楊玉　徐海　羅賽男　卜范文

摘要

為了解決獼猴桃真菌病害導(dǎo)致的貯運(yùn)難題，作者從湖南、陜西兩個獼猴桃主產(chǎn)區(qū)采集的病果中分離獲得青霉菌株Q1，應(yīng)用 rDNAITS 分子標(biāo)記、BLASTn比對，結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定，確定該致病菌為草酸青霉Pencillium oxalicum。利用帶藥培養(yǎng)基法篩選出對侵染獼猴桃的青霉菌有最佳抑制作用的中草藥提取物，獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種Q1，研究中草藥提取物對果實(shí)病斑直徑的影響。結(jié)果表明：川芎、肉桂、高良姜的乙醇提取物對青霉均有較好的抑制效果，菌絲生長相對抑制率分別達(dá)到92.79%、77.67%、78.49%，其中以川芎的抑菌效果最佳。獼猴桃果實(shí)在貯藏期接種Q1菌株后，中草藥提取物處理可顯著抑制果實(shí)病斑擴(kuò)大。

關(guān)鍵詞

獼猴桃； 青霉； 鑒定； 中草藥提取物

中圖分類號：

S436.634

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017282

Identification of the pathogen causing fruit penicilliosis on kiwifruit and the

inhibition effect of Chinese herb extracts on the pathogen

CHENG Xiaomei1，2， PENG Yajun3， YANG Yu1，2， XU Hai1，2， LUO Sainan1，2， BU Fanwen1，2

（1. Hunan Horticultural Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China；

2. Scientific Observation and Experiment Station of Fruit Trees in Central China， Ministry of

Agriculture， Changsha 410125， China； 3. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of

Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstract

The aim of this study is to solve the difficulties of fungal diseases in postharvest storage and transit of kiwifruit. The pathogen of kiwi penicilliosis was isolated from the diseased kiwifruit collected from main production areas of Hunan and Shaanxi provinces and was named Q1. Based on rDNAITS sequence analysis， BLASTn alignment and traditional morphological identification， the pathogen was identified as Pencillium oxalicum. The Chinese herb extracts with the best inhibiting effects to Pencillium oxalicum were screened by drugcontaining PDA plates， and their effects on controlling disease of kiwifruit inoculated with P.oxalicum were also investigated. The results showed that ethanol extracts of rhizoma ligusticum wallichii， cinnamon and galangal all had good inhibiting effects on P.oxalicum， with the inhibition ratio of 92.79%， 77.67%， and 78.49% on mycelial growth， respectively， among which extract of rhizoma ligustici wallichii had the best antifungal activity. During kiwifruit storage， Chinese herb extracts treatment significantly decreased the lesion diameter of kiwifruit inoculated with P.oxalicum.

Key words

kiwifruit； Penicillium； identification； Chinese herb extract

獼猴桃是一種深受消費(fèi)者喜愛的水果，營養(yǎng)極為豐富。維生素C含量高，同時還含大量的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有機(jī)物和人體必需的多種礦物質(zhì)。獼猴桃果實(shí)青霉病是我國獼猴桃貯藏期的主要病害，在湖南、陜西等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)發(fā)生比較普遍，癥狀為在果面受損傷處呈現(xiàn)青綠色霉層，易于識別。病原為多種青霉，主要由傷口侵入，引起腐爛。青霉不僅引起獼猴桃腐爛，還危害柑橘、蘋果、梨、哈密瓜等的葉片和果實(shí)，引起各種貯藏病害[12]。常用于水果貯藏保鮮的抗真菌作用較強(qiáng)的中草藥成分主要有丁香、木香、大黃、荊芥、肉桂、茵陳蒿、川芎、肉豆蔻、黃連、黃芩、紫草和黃柏等[37]。本研究從湖南、陜西兩大獼猴桃主產(chǎn)區(qū)采集了青霉危害的樣本，對該病菌的致病力、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析，同時篩選出對分離菌株有較強(qiáng)抑菌作用的中草藥提取物，以期為獼猴桃貯藏期真菌病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃青霉病病果采自湖南永順、鳳凰，陜西眉縣、周至4個獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的5個果園，每個果園分別采集樣品6份，共計(jì)30份。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 L。

試劑及儀器：PCR 擴(kuò)增儀為TaKaRa Bio Inc.生產(chǎn)的 TaKaRa Thermal Cycler DiceTP600；核酸電泳儀為ADVANCEBIO Co.， Ltd生產(chǎn)的Mupid；蛋白質(zhì)電泳儀為上海天能生產(chǎn)的EPS300；電泳成像裝置采用Pharmacia Biotech ImageMaster VDS；DNA測序儀為Applied Biosystem生產(chǎn)的ABI PRISM TM 3730XL DNA Sequencer；循環(huán)測序試劑盒采用BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit；川芎、肉桂、高良姜原料均購于安徽蜀中醫(yī)藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化、致病性測定及柯赫氏法則驗(yàn)證

將發(fā)病的果實(shí)表皮用清水清洗干凈，切取5 mm×5 mm的病組織數(shù)塊，用75%的乙醇消毒10 s，隨后放入0.1%升汞消毒5 min，取出后用無菌水沖洗3次，將病組織放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中，在28℃黑暗培養(yǎng)，分離純化得到供試菌株。將分離純化的菌株在PDA平板上28℃培養(yǎng)3～5 d后用打孔器打取直徑4 mm的菌絲塊。每個處理選取健康的獼猴桃果實(shí)10個，用接種針在果實(shí)腰部將果實(shí)刺傷后將菌餅有菌絲的一面緊貼于果實(shí)傷口處，菌絲塊表面覆蓋濕棉球，放入瓷盤中密封保濕，逐日觀察各處理的發(fā)病情況。以接種不含菌PDA為對照。從接種后發(fā)病的果實(shí)上再次分離、純化和培養(yǎng)病原菌，并與原菌株進(jìn)行比較。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種到PDA平板上于培養(yǎng)箱中28℃避光培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子形態(tài)。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

從PDA平板上用牙簽挑取少量菌體于50 μL裂解緩沖液（TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR， Code No. 9164）中，在80℃下，變性15 min，變性后離心取上清作為模板。使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit（Code No. RR178）擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，DNA模板（變性反應(yīng)液）1 μL，PCR Premix 25 μL，ITS Forward primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ITS Reverse primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ddH2O 23 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min；擴(kuò)增完畢，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測[8]。PCR產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序。將所得的序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號。同時將序列作同源相似性差異分析，確定該菌株的分類地位，用NJ法（neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 中草藥提取物對青霉的抑菌作用

精選川芎、高良姜、肉桂原料切碎后，取肉桂粗粉各10 g。分別以乙醇為溶劑，索氏法提取3.2 h，提取液過濾，減壓回收乙醇至無醇味，熱水分散后放冷，石油醚（60～90℃）脫脂3次，水液濃縮，80℃干燥成干浸膏，粉碎成細(xì)粉供試[9]。分別配制肉桂、高良姜、川芎提取液母液330 mg/mL備用。取配制好的中草藥提取液母液與PDA培養(yǎng)基混合均勻制成濃度為8.25 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，將其倒入9 cm培養(yǎng)皿中，以相同量的無菌水代替中草藥母液作為對照[10]。提取物對青霉的抑菌效果采用改良的菌絲生長速率法[1113]，即在含藥培養(yǎng)基中央用直徑為4 mm的打孔器打孔，注入50 μL 1.0× 106個/mL的青霉孢子懸浮液，培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)72 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果。采用十字交叉法測量各菌落直徑，計(jì)算各處理菌落直徑的平均值和菌絲生長相對抑菌率。

抑菌率=ck-cck×100%；

公式中ck為對照組菌落的凈生長量，c為中草藥處理組菌落的凈生長量。

1.2.5 中草藥提取物對獼猴桃果實(shí)損傷接種青霉的抑菌效果

選取外觀整齊、無病蟲害和機(jī)械損傷的獼猴桃用75%乙醇消毒，晾干備用。用接種針在果實(shí)表面穿刺接種，對照組只接種Q1病原菌，處理組先接種孢子濃度為106～107個/mL的青霉孢子懸浮液50 μL，稍晾干后接種中草藥提取物處理液，同時設(shè)有空白對照。傷口晾干后將果實(shí)放在包裝盒中，外套塑料袋保濕，于26℃貯藏。每隔2 d觀察發(fā)病率和病斑直徑。持續(xù)觀察7 d。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)8個果實(shí)，果實(shí)損傷接種后病斑直徑測量采用十字交叉法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃青霉病病原菌的篩選分離及致病性測定

從30份樣品中共分離到6株具有較強(qiáng)致病性的青霉，健康獼猴桃接種這6株青霉后，其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，所有對照均無發(fā)病癥狀。對接種后發(fā)病的組織進(jìn)行再次分離均能得到與原來接種的菌落特征相同的分離物[15]。后續(xù)試驗(yàn)取菌株Q1進(jìn)行。

2.2 獼猴桃果實(shí)上分離青霉的形態(tài)學(xué)特征

如圖2a所示，菌株Q1在PDA培養(yǎng)基上的菌落為暗青色，粉粒狀，生長速度較快，邊緣呈白色。從背面觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基由淺黃色慢慢變?yōu)辄S褐色，并隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸加深。分生孢子呈念珠狀串生，單孢無色，近球形（圖2b）。

t

2.3 獼猴桃果實(shí)上分離青霉的分子生物學(xué)鑒定

將菌株Q1的ITS基因序列提交至GenBank，獲得登錄號MF669724。病原菌的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。菌株Q1和菌株L1為作者從獼猴桃感病果實(shí)中分離出的具有代表性的菌株。將所得序列作同源相似性分析，確定了該菌株的分類地位，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）表明，菌株Q1與登錄號KP735935.1和登錄號KX674635.1的同源性最高，綜合比較病原菌的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合序列比對結(jié)果可以得出，菌株Q1為草酸青霉Penicillium oxalicum[16]。

2.4 幾種中草藥提取物對青霉的抑菌情況

表1結(jié)果可以看出肉桂、高良姜和川芎提取物均對Q1的抑菌效果良好，尤其是川芎提取物對Q1的抑菌率最高，達(dá)到了92.79%。

2.5 中草藥提取物對獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種Q1的病斑直徑的影響

獼猴桃果實(shí)接種Q1菌株4 d后，病斑直徑不斷增加，但中草藥提取物處理顯著抑制了果實(shí)病斑的擴(kuò)大（圖5）。綜合比較川芎、高良姜、肉桂三種提取物的處理結(jié)果，川芎提取物的抑制效果最突出，高良姜提取物其次，最后為肉桂提取物。

3 結(jié)論與討論

中草藥提取物具有良好的殺菌作用，對人體和環(huán)境無危害，增加了水果食用的安全性，用于水果保鮮有很好的效果。將中草藥提取物應(yīng)用到食品防腐的最大優(yōu)點(diǎn)就是腐爛率低，很少甚至不影響食品的原有風(fēng)味。同化學(xué)合成的防腐劑相比，中草藥提取物不僅無毒，對人體健康也有裨益。再者，中草藥簡單易得、取材容易、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，中草藥提取物替代化學(xué)合成保鮮劑用于水果貯藏保鮮有著廣闊的發(fā)展前景。本研究對獼猴桃青霉病病原菌進(jìn)行了篩選、鑒定，應(yīng)用 rDNAITS 分子標(biāo)記分析、BLASTn比對，結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定，確定致病菌Q1為草酸青霉Pencillium oxalicum。作者從眾多中草藥提取物中篩選出川芎、高良姜、肉桂三種中草藥提取物對獼猴桃青霉病病原菌抑菌效果較好，將三種抑菌效果較好的中草藥提取物用于獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種青霉的防腐，發(fā)現(xiàn)對病斑直徑的擴(kuò)大仍有較好的抑制作用。在后續(xù)的試驗(yàn)中作者會進(jìn)一步驗(yàn)證在本試驗(yàn)中發(fā)揮抑菌作用的幾種中草藥提取物的主要抑菌成分，力爭將本試驗(yàn)結(jié)果可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐、解決獼猴桃貯運(yùn)難題。

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