煙草Hsp70基因家族的鑒定及NtHsp70Chl基因的表達分析

陳二龍 范志勇 王松峰 王德勛 朱凱 孫軍偉 蘇家恩 宋朝鵬

摘 要：為探明煙草熱激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及煙葉主脈中NtHsp70Chl基因在烘烤條件下的表達模式，對Hsp70基因家族進行了亞細胞定位、系統進化、基因結構、染色體定位，并對NtHsp70Chl基因進行了烘烤條件下實時熒光定量表達PCR分析。結果表明，煙草基因組中Hsp70基因家族共有61個成員，蛋白序列長度不等，等電點在4.52～9.75范圍內，各成員蛋白分別定位于細胞質、內質網、細胞外基質、葉綠體和線粒體中；煙草Hsp70基因家族分為6組，定位于葉綠體的成員均存在Ⅵ-a亞組；61個NtHsp70基因分布于18條染色體上，經亞細胞定位于葉綠體的基因分別位于6、17和19號染色體上；煙草Hsp70家族中具有10個基因重復和5個旁系同源基因；經RT-qPCR檢測分析，定位于煙草葉綠體中的NtHsp70Chl基因對高溫誘導的敏感性較弱。本研究為深入研究煙草Hsp70的功能奠定了基礎。

關鍵詞：煙草；主脈組織；Hsp70基因家族；生物信息學；NtHsp70Chl；高溫誘導

中圖分類號：S572.03 文章編號：1007-5119（2018）02-0008-09 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.002

Bioinformatics of Tobacco（Nicotiana tabacum）Hsp70 Gene Family and Expression Analysis of NtHsp70Chl in Midrib

CHEN Erlong1， FAN Zhiyong2， WANG Songfeng3， WANG Dexun2， ZHU Kai2，

SUN Junwei2， SU Jiaen2， SONG Zhaopeng1*

（1. College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China 2； Dali Tobacco Company of Yunnan Province， Dali 671000， Yunnan， China； 3. Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing， Ministry of Agriculture， Tobacco Research Institute of CAAS， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to study the relevant biological information of the tobacco heat shock protein 70 （Hsp70） gene family and the specific expression of the chloroplast-localized members NtHsp70Chl in tobacco midrib， subcellular location， system evolution， Gene structure， chromosome location， and real-time fluorescence quantitative expression PCR analysis were carried out. The results showed that 61 members of the tobacco Hsp70 gene family were identified. The numbers of amino acid contained in the protein sequence were different， and the isoelectric point was in the range of 4.52～9.75. And the protein members were predicted to be localized in the cytoplasm， endoplasmic Reticulum， extracellular matrix， chloroplast （4 members） and mitochondria respectively. The tobacco Hsp70 gene family was divided into 6 groups， and the NtHsp70Chl genes were all in the VI-a subgroup. 61 NtHsp70 genes are located on 18 chromosomes， and NtHsp70Chl genes were located on chromosomes 6， 17， and 19， respectively. In tobacco Hsp70 family， there are 10 duplications and 5 paralogous genes. According to RT-qPCR analysis， the NtHsp70Chl genes in tobacco midrib were weakly sensitive to high-temperature stress. This study laid the foundation for further exploration and application of tobacco Hsp70 functions.

Keywords： tobacco； midrib tissue； Hsp70 gene family； bioinformatics； NtHsp70Chl； high temperature induction

煙葉在烘烤過程中處于高溫和水分脅迫的環境[1]。Hsp70基因在高溫或干旱誘導的條件下表達量上調，Hsp70蛋白參與蛋白質的正確折疊，調節蛋白在細胞內積累，增加組織的耐熱性[2-4]。葉綠體內Hsp70蛋白可協助基質中蛋白轉運，是必要的ATP酶，與類囊體膜的形成和病原微生物入侵的嗜

基金項目：中國煙草總公司云南省公司項目“防治烘烤過程中煙葉腐爛霉變技術研究推廣”（2016YN10）、“返青寡日照等條件下難落黃煙葉的烘

烤技術研究及推廣”（2015YN20）

作者簡介：陳二龍（1992-），男，碩士研究生，主要從事煙草調制加工研究。E-mail：celyctz@163.com。*通信作者，E-mail：ycszp@163.com

收稿日期：2017-07-22 修回日期：2017-11-17

好有一定關系[5-8]。

煙葉在烘烤過程中（逆境條件）進行代謝活動，

且在一定程度上促進病原微生物的入侵或擴散，此時，細胞內一些抗性基因表達或上調，如TLHS1、LFD、NPK1和Hsp70等[9-12]。Hsp70蛋白作為分子伴侶，其N端核酸結合域（NBD）與ATP/ADP相互作用，控制C端底物結構域（SBD）以催化劑的形式調節蛋白質的折疊和積累[13-14]。Hsp70基因家族成員的功能具有多樣性，如擬南芥中的AtHsp70-15在其植株的耐熱性方面發揮重要的作用[15]，哈茨木霉菌的Hsp70基因通過轉基因表達使擬南芥對高溫以及非生物脅迫的抗性增加[16]，斑茅在干旱脅迫的條件下，Hsp70基因表達量上調，對調節細胞膜熱穩定性和水分相對含量具有積極作用[17]，部分植物體中Hsp70參與病原微生物的蛋白質折疊等[18]。Hsp70的亞細胞位置可分為4類：內質網、細胞質、線粒體及葉綠體[19]。目前，對植物Hsp70基因家族數據研究對象主要包括擬南芥[20]、胡楊[21]、水稻[22]、大豆[23]等，關于煙草Hsp70基因家族成員的研究較少。

研究煙草Hsp70基因家族成員的特征、進化和表達模式，對于進一步探討煙草中Hsp70基因家族的功能及指導煙葉的烘烤具有重要的作用。本研究在煙草全基因組的背景下，運用生物信息學的方法挖掘煙草Hsp70基因家族的潛在信息，并以煙葉主脈組織內NtHsp70Chl基因成員為研究對象，采用實時熒光定量表達探索其在熱激條件下的反應。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016年在云南省彌渡縣紅花大金元基地調制實驗室進行。

煙草（Nicotiana tabacum L）Hsp70基因家族的相關序列，下載于NCBI（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）和Sol Genomics Network（https：// solgenomics.net/）數據庫[24-25]。擬南芥的Hsp70蛋白序列來源于TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）和NCBI數據庫[26-27]。

煙草品種為紅花大金元，取樣地理位置為鳳儀鎮。取樣：（1）在常規烘烤（變黃前期干球/濕球溫度為35 ℃/35 ℃，烘烤時長8 h，煙葉狀態為葉尖變軟；變黃中期38 ℃/37 ℃，32 h，葉片達到8黃；變黃后期42 ℃/36 ℃，16 h葉片9成黃）過程中，于烘烤0、12、24、36、48、60 h隨機取頂層煙葉3片，從主脈端口向下除去1 cm，以新端口為參照，向下取2 cm，去除兩側葉耳，將3條主脈混合包裹于錫箔紙中，放于液氮中并進行標記；（2）將適熟煙葉隨機裝于3組ZLKX-Ⅱ型煙葉烘烤箱（±0.5 ℃，鄭州智聯自動化設備有限公司），第1組烘烤箱的溫濕度設定為35 ℃/35 ℃， 第2組設定為38 ℃/38 ℃， 第3組為42 ℃/42 ℃，期間的3組烘烤箱溫濕度設定均保持不變，在0、12和24 h進行取樣，步驟同上。

1.2 煙草Hsp70基因家族的鑒定

利用已獲得擬南芥Hsp70基因家族的蛋白序列為比對文件[20]，從上述數據庫中進行BLAST（1e-10），將重復序列去除，并構建本地數據庫；從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數據庫獲得具有Hsp70結構域的種子文件（PF00012）[28]，通過HMMER3.0軟件搜索本地數據庫，確認獲取的蛋白序列具有典型Hsp70結構域。采用Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）在線工具，預測煙草Hsp70的等電點、序列長度及分子質量[29]。煙草Hsp70的亞細胞定位的預測運用ProtComp（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？ topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）工具進行分析[30]。

1.3 煙草Hsp70基因的系統進化分析

運用ClustalW2軟件對煙草中61個Hsp70及擬南芥中已被確認功能的Hsp70蛋白序列進行比對[31]；MEGA6軟件將比對結果進一步分析轉化，生成進化樹，其構建方式使用鄰接法（NJ）[32]。

1.4 煙草Hsp70基因的染色體定位和結構分析

依據煙草Hsp70基因定位于染色體中的信息，采用Mapinspector 軟件呈現基因位于染色體中輪

廓圖[33]；依據兩個基因的匹配長度以及相似性是否大于80%判定基因復制，而基因是否處于同一染色 體中判定串聯復制或片段復制[34]。根據煙草Hsp70基因DNA和CDS序列的數據，采用GSDS2（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線工具繪制基因結構圖[35]。

1.5 煙草Hsp70基因的熒光定量表達分析

在亞細胞定位的結果中選擇定位于葉綠體的4個煙草Hsp70（NtHsp70Chl）基因，由于其相似性程度較高，特設計共用引物。將提取的RNA采用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）（OD260/OD280）測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，RNA逆轉錄試劑HiScript II Q RT SuperMix for qPCR由Vazyme公司生產（貨號：R223-01）。依據基因序列信息，通過Roche LCPDS2軟件設計特異性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，采用煙草L25作為內參基因，熒光定量PCR引物和擴增產物如表1。PCR使用的試劑盒為QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit （Qiagen，Germany），并在熒光定量LightCycler? 480 Ⅱ型PCR儀（Roche，Swiss）上進行反應。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。根據熔解曲線檢測擴增產物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每1 ℃采集5次熒光信號。依據2–ΔΔCT對數據進行換算[36]。

2 結 果

2.1 煙草Hsp70家族成員信息

在煙草全基因組數據中檢索，分析獲得61個煙草Hsp70家族成員，依據各成員在染色體中的定位結果，依次對其進行命名為NtHsp70-（1-61）。通過分析NtHsp70家族成員理化特性，等電點的范圍為4.52（NtHsp70-37）至9.75（NtHsp70-18）；Hsp70蛋白序列最長的為NtHsp70-60，由904個氨基酸組成，最短的序列為NtHsp70-32，由118個氨基酸組成。亞細胞定位結果表明，NtHsp70蛋白多定位于細胞質及內質網中，其家族成員數量分別為25和23個；6個家族成員定位于線粒體；4個家族成員（NtHsp70-19、NtHsp70-38、NtHsp70-41和NtHsp70-43）定位于葉綠體；僅3個家族成員定位于胞外基質。NtHsp70家族成員的詳情信息見表2。

2.2 煙草Hsp70家族成員進化與基因結構分析

以煙草Hsp70基因家族的蛋白序列與擬南芥AtHsp70-1（CAB85987）、AtHsp70-2（CAB85986）、AtHsp70-3（AAF14038）、AtHsp70-4（BAB02269）、AtHsp70-5（AAF18501）、AtHsp70-6（CAB45063）、AtHsp70-7（BAA97012）、AtHsp70-8（AAD15393）、AtHsp70-9（CAB37531）、AtHsp70-10（CAB89371）、AtHsp70-11（AAF88019）、AtHsp70-12（BAB08435）、AtHsp70-13（AAB70400）、AtHsp70-14（AAG52240）、AtHsp70-15（AAG52244）、AtHsp70-16（AAD30257）、AtHsp70-17（CAB46039）和AtHsp70-18（AAG51503）的蛋白序列共同組建系統進化樹（圖1）。篩選進化樹獲得最終聚類結果，依據拓撲結構及擬南芥家族組別劃分將其分為Ⅰ～Ⅵ組，其成員數分別為9、21、2、12、9、8個。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組內的蛋白質主要定位于細胞質（Ⅰ組NtHsp70-17和NtHsp70-22、Ⅱ組NtHsp70-18、NtHsp70-29、NtHsp70-39、NtHsp70-60和NtHsp70-61除外），Ⅳ和Ⅴ組成員主要位于內質網（Ⅴ組NtHsp70-8、NtHsp70-27、NtHsp70-30和NtHsp70-32除外），Ⅵ組中的蛋白定位于能量供應細胞器中，其中Ⅵ-a亞組的NtHsp70成員定位于葉綠體，Ⅵ-b亞組成員位于線粒體；Ⅰ和Ⅴ組屬于Hsp110/SSE亞家族，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ組屬于Dnak亞家族。NtHsp70具有5對旁系同源基因（NtHsp70-4/55、NtHsp70-19/38、NtHsp70-23/51、NtHsp70-33/34、NtHsp70-41/43）。Ⅰ組外顯子主要集中在5'端，Ⅱ組外顯子主要集中在3'端，Ⅲ組外顯子無內含子或內含子序列較短，Ⅳ組外顯子分散存在于3'端，Ⅴ和Ⅵ組的外顯子分布無明顯規律。

2.3 煙草Hsp70基因的染色體定位

為明確煙草Hsp70基因家族的組成與分布形式，依據其定位信息，制作染色體分布的信息圖（圖2）。煙草的24條染色體內分布61個NtHsp70基因，其在染色體中的分布位置有所不同，多數分布于染色體的端部；每條染色體中的NtHsp70基因個數具有差異，2號染色體含有7個基因家族成員，其成員數目最多，9號染色體含有6個家族成員，15、21和24號染色體均包含5個家族成員，1、4、22和23號染色體均具有4個家族成員，7和19號染色體均有3個家族成員，5、6、14和17號染色體中有2個家族成員，8、11和18號染色體成員數最少，均為1個基因家族成員，于葉綠體中表達的基因分別位于6、17和19號染色體，目前3、10、12、13、16和20號染色體無任何NtHsp70基因家族成員信息。通過分析基因之間的關系，發現NtHsp70基因家族中共存在10個基因復制，分別為1組（NtHsp70-44至NtHsp70-48）基因簇、5對串聯重復（NtHsp70-10/11、NtHsp70-13/14、NtHsp70-36/37、NtHsp70-49/50、NtHsp70-58/59）和4對片段重復（NtHsp70-16/57、NtHsp70-20/42、NtHsp70-22/31、NtHsp70-28/52）。基因重復促進煙草Hsp70家族成員擴增。

2.4 NtHsp70Chl在煙草葉片主脈組織中的表達

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