煙草秸稈低聚木糖的制備和純化

蘆廣銀 吳福芳 王珅 劉文捷 馬擴(kuò)彥 戴亞 盛良全

摘要：為優(yōu)化煙草秸稈低聚木糖制備參數(shù)，采用堿解方法提取木聚糖、酶解法制備低聚木糖以及單因素實(shí)驗(yàn)法考察了常見(jiàn)因素對(duì)工藝的影響。結(jié)果表明，木聚糖提取條件為；2.000 g秸稈粉末（≤100目）浸沒(méi)于20.00 mL濃度為24%NaOH（m/v）和1%NaBH4m/v）堿液中，70℃條件下浸提4h，濾液加3倍乙醇體積用量進(jìn)行醇沉以及0.2倍乙酸體積用量進(jìn)行中和。制備低聚木糖的條件為：溶液pH為5.50，溫度40℃，時(shí)間6h，木聚糖溶液（20 mg/mL）10 mL，木聚糖酶液（0.6%，m/v4.1 U/mL）20 mL。低聚木糖分離提純條件為：陽(yáng)離子樹(shù)脂柱分離純化，填充高度18.0 cm.直徑為4.5 cm：純化液用高效液相色譜進(jìn)行定性定量分析。通過(guò)上述方法得到的低聚木糖產(chǎn)品純度較高，對(duì)工業(yè)制備低聚木糖工藝優(yōu)化有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：煙草秸稈；木聚糖；低聚木糖；純化

低聚木糖又稱(chēng)木寡糖，由2～7個(gè)D-木糖以β-1，4一糖苷鍵結(jié)合而成，以木二糖和木三糖為主，有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和耐酸性，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖，有益于腸胃健康，還有潤(rùn)腸通便，提高免疫力、抗腫瘤、降低血壓、血糖、血清膽固醇，防齲齒、清口臭、促進(jìn)鈣吸收等生物學(xué)作用，可以用于功能性保健食品中：木聚糖是半纖維素的主要成分，是一種復(fù)雜的存在于植物細(xì)胞壁的多聚五碳糖，約占植物細(xì)胞干重的15%～30%，碳水化合物含量豐富，是自然界中豐富的可再生資源。國(guó)內(nèi)外研究制備低聚木糖的方法主要有酸水解法、熱水抽提法、微波降解法、酶解法。酸水解法是利用硫酸或者鹽酸直接作用于木聚糖粗品使其發(fā)生降解反應(yīng)，反應(yīng)周期短、降解效果好，但由于是強(qiáng)酸參與反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行程度難以控制、容易腐蝕設(shè)備以及生成大量有害的副產(chǎn)物，例如糠醛酸等，所以不適宜低聚木糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)：熱水抽提法以水為原料，通過(guò)自水解法制備低聚木糖，但此法需要耐熱耐壓設(shè)備，生產(chǎn)成本高且產(chǎn)率低：微波輔助酸水解法能夠更有效地促進(jìn)酸水解，但仍存在生產(chǎn)成本高和反應(yīng)不完全的問(wèn)題：酶解法通過(guò)木聚糖酶將木聚糖降解為低聚木糖，木聚糖酶是一種以?xún)?nèi)切方式作用于木聚糖的β-1，4-糖苷鍵從而降解木聚糖的水解酶，此法操作簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少，為后續(xù)低聚木糖的分離純化提供了便利，適合工業(yè)上大規(guī)模制備低聚木糖。初步統(tǒng)計(jì)，我國(guó)秸稈年產(chǎn)量達(dá)9億t，綜合利用率不到40%，秸稈的綜合利用可以解決資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外研究者致力于從玉米芯、稻殼等原材料中制備低聚木糖，利用煙草秸稈制備低聚木糖的研究鮮有報(bào)道。因此本文主要研究從煙草秸稈中制備低聚木糖以及低聚木糖的分離純化，以期為煙草秸稈的綜合利用提供新思路。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

煙草秸稈生產(chǎn)地：安徽省阜陽(yáng)市潁泉區(qū)周棚鎮(zhèn)：生產(chǎn)年份：2016年6月：成分組成：煙草秸稈中纖維素含量42.72%，半纖維素含量24.14%，木質(zhì)素含量23.01%：

試劑氫氧化鈉（AR，西隴化工股份有限公司）、三水合乙酸鈉（AR，西隴化工股份有限公司）、冰醋酸（純度大于99%，天津博迪化工股份有限公司）、工業(yè)酒精（95%）、3，5一二硝基水楊酸、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、硼氫化鈉（純度大于98%，上海麥克林生化股份有限公司）、酒石酸鉀鈉、木聚糖酶（純度大于97%，上海源葉生物科技有限公司）、木糖（純度大于99.0%，上海展云化工有限公司）、木二糖（純度大于98%，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）、陽(yáng)離子樹(shù)脂、甲醇（色譜級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆⒁译妫ㄉV級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

主要儀器：YB-500A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）：UP型超純水機(jī)（優(yōu)普儀器有限公司）：恒溫水浴振蕩器（南京先歐儀器制造有限公司）：SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）：PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）：YL9100高效液相色譜系統(tǒng)；YL9181蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）（托摩根生物科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)流程

1.2.1木聚糖的提取

利用高速多功能粉碎機(jī)將煙草秸稈粉碎成粉末，過(guò)100目篩，置于干燥潔凈的燒杯中，60℃下烘干備用。稱(chēng)取2.000 0 g秸稈粉末于250 mL錐形瓶中，并加入16.00 mL 24%（m/v）功NaOH和1%（m/v）功NaBH4混合溶液，密封后于70℃的恒溫水浴振蕩器中振蕩反應(yīng)（振蕩速度100 r/min）4h，3000 r/min離心20min。取上清液，沉淀用適量蒸餾水洗滌并真空抽濾2次，合并2次濾液于500 mL燒杯中進(jìn)行濃縮，加入3倍體積的工業(yè)乙醇沉淀，再加入0.2倍體積的冰醋酸中和。醇沉完成后真空抽濾，將所得濾渣60℃條件下干燥6 h，即得到黃褐色木聚糖粗產(chǎn)品（圖1）。

1.2.2木聚糖酶的配制（0.6%，m/V）

精確稱(chēng)取0.060 0 g的木聚糖酶于潔凈的小燒杯中，并加入40.00 mL的乙酸一乙酸鈉緩沖液（pH為5.50），磁力攪拌30 min，用pH5.50的緩沖液定容至100.00mL，4℃條件下保存1周，備用。

1.2.3木聚糖的配制（20.00 mg/mL）

精確稱(chēng)取2.000 0 g煙草木聚糖粉末于小燒杯中，并加入40mL的乙酸一乙酸鈉緩沖液（pH 5.50），磁力攪拌30min，用pH 5.50的緩沖液定容至100.00 mL，4℃條件下保存。

1.2.4低聚木糖的制備吸取1.2.3中所述木聚糖溶液和1.2_2中所述木聚糖酶液（0.6%，m/V，酶活力為4.1 U/mL）各10.00 mL，再用0.10 mol/L pH5.50的緩沖液定容至30.00 mL，40℃水浴酶解6 h后，100℃條件下5min滅活。

1.2.5還原糖的測(cè)定

1.2.6低聚木糖的分離純化

酶解液采取過(guò)柱脫鹽處理，分別通過(guò)陰離子樹(shù)脂和陽(yáng)離子樹(shù)脂柱進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子樹(shù)脂更能有效地脫鹽。將經(jīng)滅酶處理并冷卻至室溫的酶解液通過(guò)陽(yáng)離子樹(shù)脂柱進(jìn)行脫鹽處理，0.45 gm濾頭過(guò)濾后采用HPLC進(jìn)樣檢測(cè)分析。

（1）色譜條件：色譜柱，安捷倫ZORBAXCarbohydrate（4.6 mmx250mm，5μm）（南昌捷島科學(xué)儀器有限公司）：流動(dòng)相，乙腈/水（V/V=75/25）；流速1.0mL/min：恒溫器溫度25℃：ELSD SprayChamber溫度30℃：Drift Tube溫度60℃：載氣為高純氮（>99.999%），壓力0.5 MPa趲樣量20μL。

（2）低聚木糖的濃度計(jì)算公式：

（3）陽(yáng)離子樹(shù)脂柱長(zhǎng)及用量對(duì)脫鹽的影響：分別取8份酶解后的溶液（25 mL）以流速為1.6mL/min經(jīng)過(guò)填充高度為4.0-8.0 cm、直徑為4.5 cm（面積為20.25兀）和體積用量比為2-10倍的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱（732，下同）進(jìn)行脫鹽處理。

1.2.7試驗(yàn)條件優(yōu)化分別按照1.2.1、1.2.4和1.2.6的方法，選擇影響木聚糖提取、酶解和低聚木糖分離純化的常見(jiàn)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定上述反應(yīng)的最優(yōu)條件。

2結(jié)果

2.1木聚糖提取條件的優(yōu)化

圖2表明，在1～4 h內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，木聚糖提取率快速增加，而4 h以后提取率增加趨勢(shì)不明顯。在使用1～3倍乙醇體積進(jìn)行醇沉?xí)r，隨著乙醇用量的增加，木聚糖的提取率也在快速增加，之后趨于穩(wěn)定。隨著乙酸用量增加，木聚糖提取率大幅增加，0.6倍體積乙酸時(shí)，木聚糖提取率最高達(dá)到40.17%，但產(chǎn)品顏色加深，雜質(zhì)增加（見(jiàn)討論），考慮到產(chǎn)品純度，采用添加0.2倍體積乙酸中和堿液，此時(shí)木聚糖提取率達(dá)到24.89%。在固液比為1：10之前，木聚糖提取率隨著堿液體積的增加而快速增加，之后趨于穩(wěn)定。堿解溫度在35～70℃，木聚糖提取率快速增加，之后趨于穩(wěn)定。NaOH濃度在5%-24%（m/v）時(shí)，木聚糖提取率快速增加，在濃度為24%時(shí)達(dá)最大值，高于24%后木聚糖提取率下降。

綜合以上結(jié)果，優(yōu)化的木聚糖提取條件為：濃度為24%（m/v）NaOH和1%（m/v）NaBH4的堿液，固液比1：10（m/v），水浴70℃，時(shí)間4 h，3倍乙醇體積醇沉和0.2倍乙酸體積中和。

2.2木聚糖制備低聚木糖的酶解條件

圖3表明，在1-6 h時(shí)間內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量逐漸增加，之后趨于穩(wěn)定：酶添加量在2～20 mL（0.6%，4.1 U/mL）時(shí)，還原糖含量逐步增加，為20 mL時(shí)達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定：木聚糖溶液（20 mg/mL）添加量在2～10 mL時(shí)，還原糖含量逐漸增加，10 mL達(dá)到最大值，之后還原糖量逐步降低：隨著pH值的增加，還原糖含量先增加后降低，溶液pH為5.50時(shí)，還原糖含量最高：在35-40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，還原糖含量逐漸增加，超過(guò)50℃后，還原糖含量逐降低。

綜合以上結(jié)果，優(yōu)化的低聚木糖制備條件為：10 mL木聚糖溶液（20 mg/mL），20 mL木聚糖酶液（0.6%，4.1U/mL），緩沖溶液體系pH為5.50，水浴溫度40℃，時(shí)間6 h。

2.3低聚木糖的分離純化

本研究采用緩沖溶液色譜峰的面積變化來(lái)表征脫鹽效果，峰面積越小說(shuō)明脫鹽效果越好，保留時(shí)間3 min左右。圖4 a為陽(yáng)離子樹(shù)脂柱填充高度對(duì)脫鹽的影響，當(dāng)樹(shù)脂柱填充高度高于10 cm時(shí)，陽(yáng)離子樹(shù)脂柱脫鹽效果明顯，當(dāng)高于18 cm，此時(shí)陽(yáng)離子樹(shù)脂柱可將酶解液中的鹽完全脫去：圖4 b為陽(yáng)離子樹(shù)脂用量對(duì)低聚木糖產(chǎn)率的影響，當(dāng)酶解液分別通過(guò)2、4、6、8、10倍體積陽(yáng)離子樹(shù)脂柱的低聚木糖的產(chǎn)率分別為16.36%、26.66%、30.32%、16.26%、3.60%，綜合脫鹽效果和低聚木糖產(chǎn)率兩方面考慮，選擇用6倍體積的陽(yáng)離子樹(shù)脂柱處理酶解液，此時(shí)脫鹽效果較好，且木糖與木二糖能較好的分開(kāi)：圖4 c為3 mg/mL木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，保留時(shí)間7.5min左右：圖4d為0.6mg/mL木二糖標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖，保留時(shí)間9.5 min左右：圖4 e為酶解液過(guò)6倍體積樹(shù)脂柱后的色譜圖，3 min的色譜峰面積很小，說(shuō)明此法脫鹽效果好，圖中每個(gè)色譜峰分別表示的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖，其中木二糖含量最高。

3討論

提取時(shí)間增加，煙草秸稈半纖維素（主要是木聚糖）與其他物質(zhì)之間的共價(jià)鍵容易被破壞，木聚糖充分溶解于堿液中，木聚糖提取率快速提高，結(jié)果表明4 h后提取率趨于穩(wěn)定：而長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境，易生成大量的單糖，故4 h為較適宜的時(shí)間。隨著乙酸用量增加，木聚糖易出現(xiàn)乙酰化反應(yīng)，且可溶性木質(zhì)索等物質(zhì)在酸性環(huán)境中易沉淀，之后采用酸解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行木聚糖粗品純度鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品純度隨乙酸用量增加逐步降低，顏色加深，易潮解有異味，黏性較大，0.2體積用量的產(chǎn)品純度最高，故使用0.2倍體積用量的乙酸中和堿液。溶液溫度升高，增加溶劑和木聚糖分子的動(dòng)能，加快分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，原料充分溶脹，之后溫度繼續(xù)升高，木聚糖提取率增加不到0.5%，但會(huì)加重糖的水解和脫水作用，生成一定量的有害物質(zhì)如糠醛等，顏色加深，因此70℃為較適宜的水浴溫度。堿液濃度增加，水解作用增強(qiáng)，半纖維素與纖維素、木質(zhì)素之間的共價(jià)鍵容易被破壞，但過(guò)高的堿液濃度會(huì)破壞木聚糖分子的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)，圖中結(jié)果表明，24%的NaOH溶液最為適宜。

由于木聚糖酶與木聚糖分子接觸不夠充分，隨著水解時(shí)間增加，還原糖含量逐漸增加，超過(guò)6 h后，還原糖含量變化不再明顯，說(shuō)明木聚糖降解完全，故選擇的最佳酶解時(shí)間為6 h：木聚糖溶液添加量超過(guò)10 mL后，還原糖含量開(kāi)始下降，這是由于木聚糖溶液的黏度較大，不利于木聚糖酶及木聚糖分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，影響彼此接觸。pH和溫度對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有影響，所以每一種酶都有一個(gè)最佳pH和溫度，結(jié)果表明該木聚糖酶的最適pH和溫度分別為5.50的乙酸一乙酸鈉緩沖液和40℃。

提取木聚糖和制備低聚木糖的方法很多，但都存在一定的局限性。酸法提取木聚糖會(huì)產(chǎn)生大量的單糖和副產(chǎn)物，反應(yīng)速度快且難以控制：微波法工藝不成熟，成本高：高溫蒸煮法成本高，周期長(zhǎng)，副產(chǎn)物多：蒸汽爆破法反應(yīng)溫度太高，產(chǎn)品顏色太深：堿解法得到的木聚糖產(chǎn)率最高，試驗(yàn)中堿性廢液處理得當(dāng)，對(duì)環(huán)境污染小，與其他方法相比具有產(chǎn)率高，操作簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)。酸水解法制備低聚木糖反應(yīng)迅速，生成大量木糖：熱水抽提法得到的產(chǎn)品顏色深，不利于后續(xù)的分離純化：微波降解法成本高，對(duì)設(shè)備要求比較嚴(yán)格：與其他方法相比，酶解法反應(yīng)條件溫和，具有專(zhuān)一性，目前我們實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶的固定化，降低了實(shí)驗(yàn)成本。后期將通過(guò)放大試驗(yàn)，繼續(xù)探究堿解和酶解法工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)低聚木糖以及采用膜分離技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步分離純化。

4結(jié)論

本研究采用堿解法從煙草秸稈中提取木聚糖和酶解法制備低聚木糖，與其他方法相比，具有簡(jiǎn)便、快速、安全、污染小的特點(diǎn)，原料（煙草秸稈）來(lái)源廣泛，成本低，可以循環(huán)利用，為煙草秸稈的綜合利用提供了新思路，對(duì)實(shí)現(xiàn)低聚木糖的大規(guī)模生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。低聚木糖的純化分離技術(shù)尚處在研究之中，接下來(lái)會(huì)嘗試采用膜分離技術(shù)進(jìn)行低聚木糖的分離純化，以期掌握簡(jiǎn)便、快速、無(wú)污染的技術(shù)制備煙草秸稈低聚木糖，更好地綜合利用煙草秸稈。