烤煙苗期枯萎病原菌鑒定及室內藥劑毒力測定

張恒 朱迪 何現梅 彭麗娟

摘 要：為了解貴州安龍烤煙苗期枯萎病原菌種類，篩選防治該病害化學藥劑，采用組織分離法對貴州安龍煙苗枯萎病發病組織進行病原分離，結合形態特征、rDNA-ITS序列比對鑒定病原菌，并進行致病性測定。選用6種藥劑，采用生長速率法測定供試藥劑對病原菌菌絲抑制率。結果表明，芬芳鐮孢（Fusarium redolens）為引起烤煙枯萎病的病原菌；室內毒力測定表明，40%氟硅唑EC、42.4%唑醚?氟酰胺SC對烤煙枯萎病菌菌絲生長有較好的抑制作用。

關鍵詞：烤煙；芬芳鐮孢；病原鑒定；殺菌劑

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）06-0036-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.006

煙草作為我國重要的經濟作物之一，對增加國家財政稅收、促進國民經濟發展具有重要意義[1-2]。育苗是烤煙生產的首要環節，是獲得優質、適產、高效、低成本煙葉的先決條件[3]。目前，漂浮育苗是我國最主要的育苗方式[4]，培育得到的煙苗具有根系發達、苗株健壯、煙苗整齊度高等優點，有利于集約化統一管理和實現育苗工場化，煙苗素質標準化，栽培管理專業化[5-6]。蔣世君[7]研究發現河南省烤煙苗期發生煙草灰斑病，羅正友等[8]在貴州省金沙縣和安順市西秀區煙草漂浮苗上也發現了煙草灰斑病（Alternaria pluriseptata）。汪漢成等[9]在貴州省煙草科學研究院烤煙漂浮育苗大棚中發現由九州鐮孢菌（Fusarium kyushuense）引起的煙草莖部腐爛病。因此，隨著漂浮育苗技術的廣泛應用，煙草苗期病害發生有逐漸加重趨勢。烤煙苗期病害的診斷與防治，對培育無病壯苗，生產優質煙葉具有重要意義。2016年在貴州安龍部分烤煙育苗小棚中發生了苗期枯萎病，采集苗期枯萎病標本，經實驗室分離、純化和鑒定，并進行室內藥劑毒力測定。以期為烤煙苗期枯萎病害的診斷、防治提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烤煙苗期枯萎病病害標本于2016年4月22日在貴州安龍棲鳳街道吳家莊育苗小棚采集，品種為云煙87。致病性測定煙苗由貴州大學農學院植物病理實驗室培育，品種為云煙87。

1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂凝膠（PDA）培養基[10]：用于烤煙苗期枯萎病菌分離、菌落外觀形態觀察、室內藥劑篩選。馬鈴薯葡萄糖（PD）培養基[10]：用于烤煙苗期枯萎病菌接種用孢子懸浮液制備。康乃馨葉片（CLA）培養基[11]：用于烤煙枯萎病菌顯微形態觀察。

1.3 病原菌分離鑒定

1.3.1 病原菌分離 取發病煙苗根、莖部，采用組織分離法分離，純化后菌株保存于PDA斜面培養基上和無菌水中，于4 ℃冰箱保存備用[10]。

1.3.2 致病性測定 采用孢子懸浮液蘸根法、根部刺傷法、土壤接種法等[10]3種方法將病原菌接種到健壯無病的云煙87煙苗上。用血球計數板將分生

孢子數調節到1×104個/mL，孢子懸浮液現配現用[12]。每種方法接種5株煙苗，4次重復，以無菌水為對照，7 d后觀察煙苗發病情況。對接種發病煙苗根、莖部進行組織分離，純化培養的菌株與1.3.1所述菌株同時進行鑒定。

1.3.3 病原菌形態 將菌株接種于PDA、CLA平板上，于28 ℃恒溫培養箱中培養，觀察菌落在PDA平板上外觀形態；5 d后從CLA平板上挑取少許菌絲制片鏡檢，觀察大型分生孢子、小型分生孢子、產孢細胞、厚垣孢子等，測量大型、小型分生孢子大小（n=50）。參考文獻[13]的分類系統，對分離的病原菌進行形態鑒定。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列 用滅菌手術刀刮取足量病原菌絲，使用微量基因組DNA試劑盒（型號：D3096，廠家：Omega Bio-Tek公司）提取病原菌DNA，PCR反應體系與擴增程序參見文獻[14]。

PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果經Blast后與NCBI數據庫中已知序列進行同源性比較。依據致病性測定結果、病原菌形態特征，結合同源性比較結果，鑒定烤煙苗期枯萎病菌種類。

1.4 室內藥劑毒力測定

1.4.1 供試藥劑 6種供試藥劑種類及生產廠家見表1。

1.4.2 毒力測定 采用生長速率法測定供試藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲生長的抑菌活性[10]。采用含毒介質法，將6種藥劑稀釋不同倍數后，配制不同濃度的PDA含藥培養基平板[15]。培養6 d后，十字交叉劃線法測量菌落直徑，測量結果取平均值，計算供試藥劑的相對生長抑菌率[16]。

抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100

根據各藥劑生長抑制率和濃度值建立毒力方程y=a +bx，得各藥劑的EC50值及相關系數r。數據處理分析軟件為農藥室內生物測定數據處理系統（武漢市蔬菜科學研究所﹑農業部農藥檢定所）[17]。

2 結 果

2.1 危害癥狀

煙苗染病后，初期表現為葉片輕微褪綠，植株矮小，長勢不好；根部受害明顯，主根和須根腐爛發黑；發病嚴重時葉片發黃至發白失綠，甚至死亡（圖1）。

2.2 病原菌致病性測定

接種7 d后觀察，孢子懸浮液蘸根接種（圖2a）、土壤接種（圖2b）和根莖部刺傷接種（圖2c）均使煙苗發病。染病后，初期表現為葉片萎蔫發黃，根部受害明顯，主根和須根短小，根量少，腐爛發黑（圖3a）。

從回接煙苗病株組織再次分離病原物，結合形態學特征與ITS序列，兩次分離的培養物一致，符合柯赫氏法則，證明該菌株為烤煙苗期枯萎病菌。

2.3 病原菌形態特征

CLA培養基上，菌絲蛛網狀，菌落白色，無色素。由圖4看出，PDA培養基上，菌落初為白色，后逐漸轉為青蓮色，菌落平滑，具一圈輪紋，菌絲羊毛狀，生長初期菌絲生長較快，呈放射狀，28 ℃培養4 d后，菌落直徑為4.2 ～ 4.6 cm。大型分生孢子為馬特型，分隔較不明顯，多為1 ～ 3 隔，基胞、頂胞稍顯鈍圓，量度為 31.2～42.2 μm×3.7～6.3 μm。小型分生孢子數目較多，多為卵形或腎形，分隔不明顯，多為0～1隔，量度為6.2 ～14.34 μm×2.30～4.13 μm。產孢細胞為單瓶產孢梗，未觀察到厚垣孢子。根據以上形態特征，初步鑒定為芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列比對

病原菌rDNA-ITS序列與NCBI數據庫中的已知序列比對，結果顯示，與芬芳鐮刀菌（F. redolens）同源性為100%。

2.5 室內毒力測定

表2結果表明，6種藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲生長均有不同程度抑制作用，藥劑濃度與菌絲生長抑制程度成正相關。6種藥劑對烤煙枯萎病菌的毒力從大到小依次為40%氟硅唑EC > 42.4 %唑醚?氟酰胺SC > 40 %百菌清SC > 70% 丙森鋅WP > 64 %噁霜靈錳鋅WP > 2 %春雷霉素SL。其中40 %氟硅唑EC抑菌效果最好，EC50值為0.64 mg/L；其次是42.4 %唑醚?氟酰胺SC，EC50值為4.94 mg/L；抑菌效果最差的是2 %春雷霉素SL，EC50值為1 025.86 mg/L。6種藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲抑制作用見圖5～10。

3 討 論

由鐮孢屬（Fusarium）真菌引起的植物枯萎病，世界范圍內廣泛分布，寄主包括經濟作物、茄科作物、瓜類作物、花卉植物等[18]。枯萎病菌為土壤習居菌，主要以菌絲體、厚垣孢子在土壤及未腐熟綠肥中越冬，主要靠病苗、病土和流水傳播[19]。汪漢成等[20]對貴州主栽的4個烤煙品種裸種進行帶菌檢測，4個烤煙品種裸種上均攜帶病原真菌，優勢菌群主要為鏈格孢屬（Alternaria）、芽枝孢菌屬（Cladosporium）、鐮孢菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibberella）等4個屬的真菌。由此推斷，安龍煙苗發生枯萎病的原因一種可能是育苗基質或育苗盤未徹底消毒，其中可能含有引致安龍烤煙苗期枯萎病的鐮孢屬真菌；另一種可能是烤煙種子帶菌。雖然烤煙包衣劑內含有殺菌劑，但添加的殺菌劑有可能對鐮孢屬真菌無抑制作用。對烤煙苗期土壤或種子傳播的病害，選用無病種子和育苗基質，做好育苗大棚和育苗盤的消毒，可一定程度降低該類病害發生幾率。

汪漢成等[9]在貴陽發現的引起烤煙苗期莖部腐爛病的病原菌為九州鐮孢（F. kyushuense）。本文從發病煙苗上分離致病菌，結合rDNA-ITS序列比對與形態特征，鑒定安龍烤煙苗期枯萎病的病原菌為芬芳鐮孢（F. redolens）。2種苗期病害從癥狀上看，九州鐮孢主要引起煙苗腐爛，芬芳鐮孢主要引起煙苗枯萎。

目前，利用化學藥劑防治作物枯萎病仍是較為有效的方法之一，我國生產上用于防治作物枯萎病較好的藥劑主要有唑類、甲酯類、酰胺類等[21]。本文通過室內毒力測定發現，40%氟硅唑EC對烤煙苗期枯萎病菌抑制效果最好，其次為42.4%唑醚·氟酰胺SC。因此40%氟硅唑EC和42.4%唑醚·氟酰胺SC可做為防治烤煙苗期枯萎病的藥劑，防治效果需進一步結合田間試驗確定。

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