煙蚜蟲霉菌的篩選、鑒定及培養條件初篩

莫飛旭 喻會平 龍友華 吳小毛 黎曉茜 李磊

摘 要：為獲得對煙蚜具有感染作用的蟲霉菌，從貴州不同煙區采集受霉菌感染的煙蚜蟲尸標本進行菌株分離，在室內進行感染率測定篩選獲得優勢菌株并通過rDNA-ITS序列測定，用菌絲生長速度法探索適宜蟲霉菌生長的培養基、溫度、光照和pH條件。結果表明，采集分離獲得16株真菌，其中，感染作用較強的CM-4、CM-11和CM-15，在室內施用15 d后，對煙蚜的感染率分別達68.07%、69.80%和72.05%；通過BLAST在線比對CM-4、CM-11和CM-15 3株蟲霉菌分別與金色毛殼菌（Chaetomium aureum）、漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）同源性最高；CM-11和CM-15適宜在培養基E，CM-4適宜在培養基A條件下培養；CM-4和CM-15適宜溫度為25～30 ℃，適宜CM-4和CM-11的光照為半光照半黑暗，pH為6～7。研究表明，金色毛殼菌、漸狹蠟蚧菌和少根根霉菌對煙蚜具有較強的感染作用，可用于煙蚜的生物防治。

關鍵詞：煙蚜；蟲霉菌；培養條件；生物防治；鑒定

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）06-0043-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.007

煙蚜[Myzus persicae （sulzer）]，又名桃蚜，是煙草重要的害蟲之一，在世界范圍內均有分布。煙蚜通過刺吸式口器吸取煙葉汁液，影響煙草正常的生理功能和生長，同時煙蚜還可排泄蜜露，引起霉菌滋生，污染葉片[1]，此外，煙蚜是病毒的重要傳播媒介，可傳播CMV、PVY等病毒病，煙蚜為害可降低煙葉煙堿含量，減小煙葉面積，嚴重降低煙葉品質，給煙草生產帶來巨大的經濟損失[2]。目前煙蚜的防治主要依賴于化學藥劑，使用不當易引起污染等問題，且長期使用可造成煙蚜生理發生變異，產生可遺傳的抗藥性[3-4]。生物防治是一種清潔、綠色的防控技術，煙蚜的生物防治主要通過使用生物農藥、釋放天敵昆蟲等手段[5-6]，如利用瓢蟲[7]和蚜繭蜂[8]。

蟲霉菌是一類能寄生于害蟲蟲體，導致蟲體感染、發病、死亡的真菌。利用蟲霉菌防治害蟲是一種綠色、安全的生物防治手段。目前該技術在多種害蟲的防治上已得到廣泛使用，如白僵菌（Beauveria bassiana）防治甘薯象甲、玉米螟和馬尾松毛蟲，綠僵菌（Metarhizium）防治金龜子等[9]。而在煙蚜方面，目前有報道的煙蚜生防蟲霉菌包括白僵菌、綠僵菌[10-14]、球毛殼菌（Chaetomium globosum）[15-17]、蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）[18]、Lecanicillium longisporum[19-20]、弗氏新接霉蚜霉菌[Neozygites fresenii （Nowakowski）][21]、耳霉菌（Conidiobolus major）[22]和青霉菌（Paecilomyces sp.）[23-26]。但目前尚無一種被廣泛應用于煙蚜防控的蟲霉菌，限制這一技術發展的主要因素包括煙蚜蟲霉菌菌種資源較少、致病力弱且培養難度大，此外蟲霉菌對田間環境條件的適應性較差。基于此種情況，本試驗從貴州不同煙區采集、分離和篩選對煙蚜具有較強致病力的生防優勢蟲霉菌，以豐富煙蚜蟲霉菌菌種資源，并通過室內培養條件的初篩，為田間適用條件研究奠定基礎。以期為煙蚜蟲霉菌的研究與開發利用提供科學依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

1.1.1 試驗地點 貴州大學農產品質量安全實驗室，貴州大學作物保護研究所。

1.1.2 供試材料 供試煙草：畢納1號，2015—2016年栽培于貴州大學作物保護研究所試驗溫棚內；供試煙蚜：當年培育于畢納1號煙葉上的健康煙蚜。

1.2 試驗設計

1.2.1 蟲霉菌采集與分離 蟲霉菌采集：分別從貴州省畢節、遵義、六盤水、安順和黔西南煙區采集受蟲霉菌感染的煙蚜，其特征為已死煙蚜的蟲尸上長有菌絲，顏色一般為白色、灰色、黑色和黃色。蟲霉菌分離：將受感染的煙蚜粘在含有PDA的培養皿蓋內中央，將培養皿置于28 ℃恒溫箱內培養7 d，待PDA上長出菌落后，根據顏色和長勢不同，將菌株進行純化培養。

1.2.2 菌懸液制作 將純化后的菌株挑到PDA平板上置于25 ℃恒溫箱內培養7 d，用打孔器取0.5 cm菌餅至含有150 mL不加瓊脂的PD液體培養基的三角瓶內，將三角瓶置于25 ℃恒溫震蕩箱內培養5 d備用。

1.2.3 優勢蟲霉菌的篩選 挑30頭大小相似的健康無翅煙蚜置于15 cm×15 cm的煙葉背面，將煙葉置于培養皿內保濕培養。將菌懸液用紗布過濾掉菌絲后，噴施于煙葉和蚜蟲體上，噴至煙葉滴水。每個處理3次重復，并設置CK對照（噴施無菌水）。觀察3 d和7 d后煙蚜蟲尸是否長出霉菌來判斷是否被感染（正常死亡的煙蚜，后期蟲尸變黑色干扁，無霉菌）。從感染的蟲尸中按照步驟1.2.1進行霉菌分離，確認感染前施用的菌株與感染后分離所得的菌株是否一致。

對具有感染作用的菌株進行感染力測定：在室內盆栽煙苗，待5葉時將30頭大小相似的健康無翅煙蚜接到煙葉背部，室溫下培育15 d。在將具有感染作用菌株菌懸液用紗布過濾掉菌絲后，噴施于煙葉和蚜蟲體上，噴至煙葉滴水。每個處理3次重復，并設置CK對照（噴施無菌水）。調查7 d、11 d和15 d后煙蚜的感染率。

感染率=感染蟲口數/蟲口總數×100%

1.2.4 蟲霉菌的鑒定 采用Biomiga公司的Fungle gDNA Kit提取試劑盒提取DNA，選用ITS4/ITS5引物進行ITS基因片段擴增，PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，并將獲得的序列在NCBI中BLAST軟件進行同源性比對。

1.2.5 蟲霉菌適宜培養基的篩選 用表1中的培養基在28 ℃下對篩選得出的優勢蟲霉菌進行培養，每種培養基設3次重復，用“十字交叉法”每隔24 h測量蟲霉菌菌落直徑，并計算菌絲生長速度。

生長速度（cm/h）=菌落直徑（cm）/培養時間（h）

1.2.6 蟲霉菌適宜溫度條件的篩選 用PDA培養基在10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫培養箱中對蟲霉菌進行培養。每種溫度條件設3次重復，并每隔24 h測量蟲霉菌菌落直徑，計算菌絲生長速度。

1.2.7 蟲霉菌適宜光照條件的篩選 設置全光照、全黑暗、12 h光照12 h黑暗的光照條件且溫度為28 ℃恒溫的培養條件，用PDA培養基對蟲霉菌進行培養。每種光照條件設3次重復，每隔24 h測量蟲霉菌菌落直徑，計算菌絲生長速度。

1.2.8 蟲霉菌適宜pH條件的篩選 將蟲霉菌置于PDA平板上培養7 d，配制pH值分別3、4、5、6、7、8、9、10的PDA液體培養基各150 mL于三角瓶內，將平板上的蟲霉菌用打孔器取直徑0.5 cm的菌餅（CK為無菌PDA小塊），將菌餅分別放入不同pH值的液體培養基中，每個pH處理設3次重復，三角瓶封口后，置于28 ℃恒溫和150 r/min的震蕩箱中培養5 d。5 d后，將三角瓶內的菌液用紗布進行過濾，后將裝有濾渣的紗布置于80 ℃的烘箱內烘干8 h，取出烘干后帶有濾渣的紗布進行稱量，計算出平均菌株干物質重量。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007和Dps 7.05數據統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析，采用Duncans新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 蟲霉菌的采集、分離與篩選

2015—2016年間從貴州省畢節市、遵義市、六盤水市、安順市和黔西南州煙區共采集得感染煙蚜標本11個，分離獲得真菌菌株16株，按照采集順序標記為CM-1、CM-2、CM-3…CM-16。通過感染作用測定發現（表2），施用菌懸液3 d后僅有CM-4、CM-6、CM-9、CM-11和CM-15具有感染作用，7 d后CM-4、CM-5、CM-6、CM-9、CM-11、CM-14和CM-15等7株菌株對煙蚜具有感染作用，其他菌株均無感染作用。

將具有感染作用的7株菌株進行感染力測定。

結果如表3所示，隨施用時間的延長，各菌株處理對煙蚜的感染率不斷增大。施用菌懸液7 d后，所 有菌株對煙蚜的感染率均大于15%，其中菌株 CM-11的感染率達到22.62%。11 d后菌株CM-11 的感染率達到56.15%，高于其他菌株處理，菌株 CM-15次之，達52.33%，其次為CM-4為51.34%， 該3株菌株感染率顯著高于其他處理。15 d菌株 CM-15、CM-11和CM-4對煙蚜的感染率分別達到 了72.05%、69.80%和68.07%，均顯著高于其他菌 株，且同CK相比差異極顯著。試驗結果表明，菌株CM-4、CM-11和CM-15為感染力較強，是具有較高生防潛力的優勢蟲霉菌。

2.2 優勢蟲霉菌的鑒定

蟲霉菌CM-4、CM-11和CM-15在PDA平板上的菌落形態分別如圖1A、圖1B和圖1C所示。CM-4

菌絲體呈金黃色，培養基因菌體產生滲出物而變為紫紅色，菌落背面呈暗紫色，如圖1D所示，其孢子呈舟形、紡錘形或卵形，灰褐色，大小為9～12 μm×

5～6.5 μm；CM-11菌絲緊密，呈乳白色，背面呈米黃色（圖1E），經過多種不同條件培養，均未發現該菌株產孢；CM-15菌絲棉絮狀，褐色，孢子球形、近球形或卵形（圖1F），直徑3.5～6 μm，為無色或淺灰色。

將序列測定所獲得的序列與GenBank中已有序列進行同源性比較，結果發現，CM-4與金色毛殼菌（Chaetomium aureum）的同源性為100%，CM-11與漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）同源性為99%，CM-15與少根根霉（ Rhizopus arrhizus）同源性為100%。根據病菌形態學鑒定以及該 DNA序列在NCBI進行同源性對比雙重結果，最終確認優勢蟲霉菌菌株CM-4為金色毛殼菌，CM-11為漸狹蠟蚧菌，CM-15為少根根霉菌或稱米根霉菌。

2.3 不同培養基對蟲霉菌生長的影響

由圖2可以看出，菌株CM-15在各個培養基中的生長速度明顯高于菌株CM-4和CM-11。不同蟲霉菌在不同培養基中的生長速度均不相同，其中菌株CM-4在培養基A中的生長速度顯著高于其他培養基，達到0.032 9 cm/h；菌株CM-11在培養基E中的生長速度0.018 1 cm/h，高于其他培養基處理；菌株CM-15適應力較強，在所有供試培養基中均保持高速生長，其中在培養基E中的生長速度最大，達0.354 2 cm/h。試驗表明，在供試的7種培養基中，菌株CM-15的生長力較強，而菌株CM-11較弱。適宜CM-4生長的培養基為培養基A，而適宜CM-11和CM-15生長培養基為培養基E。

2.4 不同溫度對蟲霉菌生長的影響

不同溫度條件下蟲霉菌的生長速度如圖3所示，菌株CM-4在10 ℃時生長停止，當溫度為25 ℃時

生長速度達到最大，達0.018 2 cm/h；菌株CM-11在10～35 ℃條件下均能生長，在溫度為25 ℃時生長速度達0.010 6 cm/h，在20 ℃時達0.009 6 cm/h，兩者均顯著高于其他溫度處理；菌株CM-15在10～35 ℃條件下生長速度出現2次峰，第1次出現在15 ℃時，第2次在30 ℃，該菌株在30 ℃條件下生長速度達到最大的0.391 5 cm/h，其次為25 ℃時的0.298 3 cm/h。結果表明，蟲霉菌菌株CM-4、CM-11和CM-15適宜培養的溫度條件分別為25～30 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃。

2.5 不同光照條件對蟲霉菌生長的影響

如表4所示，不同光照條件下蟲霉菌的生長具有差異。其中，菌株CM-4和CM-11在12 h光照12 h黑暗下生長速度達到最大分別為0.020 7 cm/h 和0.009 0 cm/h，但菌株CM-4和CM-11在不同光照條件下的生長速度差異不顯著，表明CM-4和CM-11的光照條件適應能力較強；菌株CM-15在不同光照條件下的生長速度差異顯著，其在全黑暗條件下生長速度最大，達0.281 2 cm/h。由此可見，菌株CM-4和CM-11可適應不同光照條件下培養，而菌株CM-15適宜在全黑暗條件下培養。

2.6 不同pH對蟲霉菌生長的影響

如圖4所示，菌株CM-4和CM-11在pH值為7時，產生干物質分別達到最大，其次為pH 6時，且二者均顯著高于其他pH處理，其中CM-11在pH為3時停止生長。表明pH 6～7是菌株CM-4和CM-11的適宜培養酸堿條件。CM-15在pH 5時干物質達到最大，達0.39 g，其次為6時的0.37 g，均顯著高于其他pH條件。綜上表明菌株CM-4和CM-11喜好酸堿度為中偏酸的環境條件；CM-15適宜在偏酸條件下培養。

3 討 論

毛殼菌屬（Chaetomium sp.）真菌中，球毛殼菌（Chaetomium globosum）對蚜蟲等多種害蟲具有防控作用[27]，而金色毛殼菌（Chaetomium aureum）此前多報道用于病害防控，其與辣椒疫霉病、灰霉病和黃瓜灰霉病有拮抗作用[28-30]，而用于煙蚜防治尚無相關報道；KIM等[31]曾從蚜蟲蟲體中分離獲得漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum），并發現其對煙蚜、棉蚜等具有寄生致死作用，本試驗結果進一步驗證該菌株的致病力，此外，漸狹蠟蚧菌還可用于防控柑橘粉虱[32]、茶小綠葉蟬[33]和南方根結線蟲[34]；少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）作為醫學病原菌，可引起人體多種皮膚病[35]，因此其安全性尚需進一步探究。

關于蟲霉菌對蚜蟲的致死機理，臧建成[36]認為暗孢耳霉（C.obscurus）通過菌絲侵入蚜蟲體內，利用寄主體內營養進行生長繁殖所致；李武高[21]等報道弗氏新接霉通過體壁穿透和機械壓力的方式殺死蚜蟲；GURULINGAPPA等[37]發現蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）菌絲體能產生對棉蚜具有毒力作用的乙酸乙酯和甲醇等毒素。GLISZCZYNSK等[38]認為將生防菌基因進行轉化可增強其致病力。本試驗尚未對篩選出的3株致病霉菌進行相關致病因子探索。

生防蟲霉菌使用技術的另一難點在于菌株的田間條件適應性能，一般自然條件適應力較強的菌株更具有開發利用前景[39-40]。除菌株天然的適應力外，還可通過人工馴化、基因轉化[38]或定殖于植物中[41]等措施來提高菌株適應力，本試驗對所獲得的3株蟲霉菌進行培養條件初篩，可為菌株適應力及田間施用條件研究奠定基礎，但要確定培養基、溫度、光照、pH等條件的互作關系，明確適宜的培養條件，仍需要做進一步的互作試驗探究。

4 結 論

試驗篩選獲得了金色毛殼菌（Chaetomium aureum）、漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌 （Rhizopus arrhizus） 3株對煙蚜具有較強致病力的生防蟲霉菌株，其中金色毛殼菌和少根根霉對煙蚜的感染作用屬首次報道，豐富了煙蚜生防菌資源。

通過初步篩選分別獲得了適宜3株菌株生長的溫度、pH和光照條件，為該菌株培養保存和田間施用技術研究奠定基礎。

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