家畜中抗菌素耐藥性：抗生素的進展與替代（續1）

張江

上期回顧：本篇文章上期主要闡述了最近動物飼料行業使用抗生素的進展情況和抗生素替代品的概況，其中包括：使用CRTSPR/Cas基因編輯系統逆轉抗生素耐藥性并用作抗菌劑、增強抗茵效力的抗生素綴合物、以噬菌體作為抗菌劑、設計用于控制體內微生物疾病的抗菌肽以及使用化學合成的病毒樣納米粒子（納米抗生素）殺死致病茵。

中圖分類號：S831.5? ?文獻標志碼：C? ?文章編號：1001-0769（2018）07-009604

7 宿主防御/先天免疫

免疫系統由先天（非特異性）和適應性（特異性）應答組成。先天免疫是結構性存在的，并在感染后迅速動員起來。先天免疫也被稱為非特異性免疫，因為無論初始感染如何，保護性應答都是相同的。相反，適應性免疫系統響應較慢，并會產生免疫記憶。如果人體的第一道防線一一先天性免疫系統一一在消滅病原體方面不成功，大約4 d～～7 d后特定的適應性免疫應答便啟動。這意味著適應性防御需要更長的時間，但它能更準確地針對病原體。增強動物免疫系統可減少抗生素的使用。

8 疫苗是解決抗生素耐性的重要藥物

人類和動物接種疫苗是預防感染、降低抗生素需要的一種有效方法。更好地利用現有疫苗及開發新疫苗是解決抗生素耐藥性、減少可預防疾病及動物死亡的重要途徑。亞單位疫苗、脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）疫苗和核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）疫苗是完整致病菌疫苗有吸引力的替代品。佐劑是疫苗非常重要的成分，因為它們可減少產生免疫效果所需疫苗的劑量和份數。有三種含有toll樣受體激動劑佐劑或其聚合物：胞嘧啶（poly-c）或CpG寡脫氧核苷酸、宿主防御肽和聚磷腈。合成的胞嘧啶和CpG寡脫氧核苷酸是眾所周知可增強免疫應答的有效佐劑。宿主防御肽是一種天然肽的衍生物，它是一種帶有陽離子（帶正電）兩親性的肽，具有免疫調節功能。聚磷腈是一種合成的水溶性生物可降解聚合物，具有刺激免疫的功能，可與病毒和細菌抗原形成非共價復合物，以提高其免疫原性和穩定性。三個佐劑在小鼠、大鼠、豬、綿羊、雞和考拉中穩定高效，與多種抗原一起使用時，可有效誘導長效的體液免疫和細胞免疫。研究人員應用不同的方法將富含CpG的寡核苷酸與糖聚合物連接形成可溶性納米顆粒佐劑，這種可溶性納米顆粒佐劑與重組炭疽抗原進行單次免疫可誘導猴子產生高滴度的抗體，完全保護它們免受致死性炭疽攻擊。這種可溶性納米顆粒佐劑應該是有一種有應用前景的佐劑，因為它可以通過單次免疫刺激動物機體產生抗體。

采用一種完全不同的疫苗接種方法可將能表達特異性抗原DNA序列的質粒直接導入動物組織中，從而獲得免疫應答。研究人員證明陽離子脂質體制備的乙型肝炎病毒DNA疫苗在豬中產生的免疫應答與一種蛋白疫苗安在時（EngerixB）產生的免疫應答量級相當。有研究人員開發出帶電（陽離子）的DNA復合微針疫苗。他們發現這種疫苗的免疫反應比傳統給藥高出3.5倍。這種新型微針疫苗具有持久的免疫力，生產成本低，在動物中易于施用，具有較長的保存期，并且可以適用于控制幾乎任何種類動物的疾病。最新的方法是使用mRNA來制備疫苗。雖然DNA疫苗和mRNA疫苗有許多相似之處，但兩種疫苗之間的主要差異在于寡核苷酸釋放的目標位置。DNA療法必須到達細胞核，而RNA療法的目標是胞液。mRNA疫苗可誘導有效的免疫應答，生成高濃度抗體。脂質納米顆粒作為將mRNA運送至細胞的載體可以很容易地合成，保護mRNA不被降解，并且可以與佐劑共同釋放。與DNA疫苗一樣，美國食品及藥物管理局（Food and DrugAdministration，FDA）未將RNA疫苗視為基因療法。疫苗技術的諸多進步為在動物中產生持續的高滴度抗體提供了手段，且在控制或預防動物疾病中相對便宜且高效。在RNA疫苗和DNA疫苗廣泛用于家畜和家禽之前，必須對RNA疫苗和DNA疫苗的安全性和有效性進行更多的研究。

9 應用雞卵黃抗體和植物免疫球蛋白控制家畜和人類腸道病原體

口服抗體免疫療法（被動免疫）是控制動物腸道疾病中的一種非常有吸引力和有效的方法，因為它們具有高特異性、有效性和快速作用的特點。目前已經成功使用了哺乳動物血清和初乳制備的口服抗體及單克隆抗體，但它們的成本過高。

與此相反， 被稱為免疫球蛋白Y（Immunoglobulin Y，IgY）的雞卵黃免疫球蛋白預防和控制動物疾病的效果相當引人注目，因為與哺乳動物免疫球蛋白G相比，卵黃抗體具有成本效益高、使用方便和抗體產量高等諸多優點（圖3）。口服IgY已被用于預防或治療哺乳動物、家禽和水產動物中的多種細菌性和病毒性疾病。研究人員對口服IgY控制家畜腹瀉的能力進行了薈萃分析。結果發現IgY能夠降低所有試驗動物（包括豬、小鼠、家禽和犢牛）的腹瀉發病率。他們建議進行更多的動物實驗以進一步確認單獨使用IgY或IgY與其他替代產品組合使用的功效。

盡管己證明相對少量的IgY在控制動物腸道病原體感染方面非常有效，但需要更多的研究以提高抗體治療的功效。這包括獲取中和不同程度感染所需的特異性抗體量（抗體滴度）以及治療的持續時間和頻度等信息。除了優化IgY治療方案外，選擇免疫程序提高蛋雞卵黃抗體的產量也很重要，因為這直接關系到運營利潤和生產成本。幾種新的免疫方案可用于蛋雞，使蛋黃中產生高濃度的抗體。為了提高免疫反應的效果，有必要使用佐劑，因為它可刺激產生更快、更強和更持久的免疫力。前文討論的兩種新型疫苗平臺可用于產蛋母雞，以高水平和持續地生成IgY。另一種可能的方法是使用DNA疫苗或RNA疫苗，因為它們可以廉價方式生產抗體。

一種非常有吸引力的替代抗體的來源是通過植物生產抗體。植物瞬時表達系統的出現使得在實驗室和工業化規模快速和安全生產抗體成為可能。植物生產抗體的主要特點是安全、快速、低成本和便利性，新手能夠快速掌握該技術并充分利用其優勢。使用植物進行產品開發為同時表達多種不同基因提供了動力和靈活性，從而可以構建新型生物納米材料。植物可用于生產基于抗體的超分子結構，并將在多方面得到應用。例如，可以設計耐受胃腸道pH和消化酶影響的抗體，從而減少抗體的用量。預計未來的抗體產品將可充分利用植物系統的獨特功能。幾家全球性公司擁有生產生物納米藥物的能力。

10 采用抗體包被技術防止免疫球蛋白在胃腸道中失活

口服被動免疫可能是抗體最有價值的應用之一。但是抗體必須在胃腸道環境中存活并到達發揮其生物學特性的目標區域才能產生效果。與任何蛋白質一樣，抗體對蛋白水解酶敏感。胃部的消化酶和低pH可降低或破壞IgY的活性。相反，IgY對pH 6～7的小腸和大腸中的蛋白酶作用相當穩定。針對牛IgG通過人胃腸道的研究表明，只有4%～19%抗體活性能保留下來。研究人員評估了在納米復合材料基質中的IgY對感染產腸毒素大腸桿菌仔豬的體內保護效力。受保護的IgY完全阻止了腸毒素性大腸桿菌誘導的腹瀉，而服用未受保護的IgY的仔豬腹瀉發生率為100%。這些研究表明，包被IgY可大大提高其有效性。

總之，盡管大部分的IgY在胃中失活，但是對控制動物、家禽和水產動物的多種腸道病原體感染非常有效。包被的IgY在不降解的情況下被完整地釋放到大腸，并在大腸中產生生物活性。需要研究確定治療疾病所需的IgY最佳劑量，以提高抗體的功效和成本效益。此外應使用新的免疫方法來提高蛋黃中IgY的濃度。通過植物大量低成本地生產抗體是較有前景的新方法。

11 通過口服低濃度脂質體包被型鋅來預防和治療動物的腸道疾病

仔豬日糧中添加1500 mg/kg～3 000 mg/kg的氧化鋅已廣泛用于抑制細菌對腸道的黏附和侵入，防止增重下降、吸收性絨毛萎縮和腹瀉。但是日糧中高濃度的氧化鋅會造成環境污染。歐洲允許豬日糧的氧化鋅最高含量為150 mg/kg，遠低于產生有益作用所需的濃度。最新的研究證明，日糧中添加100 mg/kg的脂質體包被型氧化鋅不僅可產生與添加2 500 mg/kg未包被氧化鋅同樣的效果，減輕斷奶仔豬腹瀉和生長遲緩，而且獲得與抗生素治療類似的效果。這些結果表明，脂質體包被型鋅和很可能其他幾種改進的鋅產品可以在低濃度下有效減輕產腸毒素大腸桿菌對豬的影響。已經證明這些改進的鋅化合物可以用于控制包括人類在內大多數動物的其他腸道疾病。

12 作為生長促進劑的攝生素

最近，動物飼料工業已經使用攝生素作為生長促進劑來替代抗生素。攝生素主要用于保持動物腸道的生態平衡，改善動物的健康狀況和生產性能。研究人員詳細評估了益生菌、益生元、有機酸、外源酶、精油和草藥等非抗生素類生長促進劑（攝生素）的益處。作者認為，益生菌和有機酸是最佳的抗生素促長劑替代品。此外利用新的基因方法，有可能會增強或開發出具有獨特口服免疫治療效果的新型益生菌。

13 動物對疾病的遺傳抗性

動物的基因型和環境之間的相互作用涉及遺傳和健康。研究人員對多種動物疾病如肉毒桿菌感染、口蹄疫和非洲豬瘟進行的品種易感性研究發現不同品種間存在差異。也有證據表明，不同品種的豬對非洲豬瘟、萎縮性鼻炎、偽狂犬、豬圓環病毒相關病、沙門氏菌病及產腸毒素大腸桿菌F4和F18感染等疾病的易感性存在差異。

表達F4（以前稱為K88）菌毛的產腸毒素大腸桿菌是新生仔豬和仔豬斷奶前腹瀉的主要原因，可造成養豬業非常大的經濟損失。研究人員描述了MUC13基因與豬腸道致病性大腸桿菌F4ac的易感性/抗性的因果關系。他們發現，MUC13A等位基因與不同豬群中F4ac非黏附表型完全相關，所有易感動物至少攜帶一個MUC13B等位基因。總體而言，他們的研究結果具有重要的實用意義，并將對豬的育種計劃產生直接影響，因為它們可以快速消除易感等位基因，因此將大大有利于動物福利和養豬業。

對其他動物疾病進行的類似研究將極大地提高人們對疾病遺傳抗性動物的選擇。這些發展不僅將減少養殖業對抗生素的需求，而且還將克服與特定疾病相關的抗生素耐藥性問題。

14 結論

最近在生物技術和納米結構材料應用方面取得了顯著的進展，新的方案不僅針對耐藥性細菌，而且可有效治療和預防各類牲畜和人類的微生物感染。這些進展包括：（1） CRIPSR/Cas基因編輯系統靶向消除細菌中抗生素抗性基因并直接殺滅微生物;（2）生產可在體內殺死細菌的噬菌體;（3）使用能夠有效殺滅微生物的基因工程肽和化學合成的病毒樣模擬物;（4）使用改良的新型免疫技術解決抗生素耐藥性問題;（5）使用卵黃抗體和植物免疫球蛋白以及包被型氧化鋅來快速有效地治療人類和動物的腸道疾病。預計上述手段將開發出安全、高效的新型抗菌產品.這些抗菌產品具有不同的作用機制，其中大部分不會引發細菌耐藥性。這些進展將明顯有助于解決抗生素耐藥性問題。

（續完）