不同蛋白酶水解鹿鞭制備活性肽的比較研究

王帥 鐘立成

摘要[目的]研究制備鹿鞭活性肽的最佳蛋白酶。[方法]選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶分別在最適條件下水解鹿鞭，以水解物鹿鞭活性肽的水解度（DH）及其對(duì)還原能力、抑制硫代巴比妥酸（TBARS）的作用和清除DPPH自由基作用的影響為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳水解蛋白酶。[結(jié)果]堿性蛋白酶水解鹿鞭產(chǎn)物鹿鞭活性肽的水解度、還原能力、對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化的抑制作用和DPPH自由基的清除率都為最高。[結(jié)論]堿性蛋白酶水解鹿鞭產(chǎn)物鹿鞭活性肽具有很好的抗氧化性。

關(guān)鍵詞鹿鞭；蛋白酶；酶水解；活性肽

中圖分類號(hào)R282.74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0109-02

Abstract[Objective]The research aimed to study the optimal protease for preparation of deer penis active peptide.[Method]The alkaline protease， neutral protease， compound protease and trypsin were respectively used to hydrolyze deer penis under optimum conditions，the degree of hydrolysis （DH） of the hydrolyzate deer penis active peptide and its effect on reduction， inhibition of TBARS and scavenging of DPPH free radical were taken as indexes to optimize the optimal hydrolytic protease.[Result]The degree of hydrolysis， reducing ability， inhibition of lecithin lipid oxidation and DPPH radical scavenging rate of alkaline protease hydrolysis deer penis active peptide were the highest.[Method] Alkaline protease hydrolysis deer penis product deer penis activite peptide has good oxidation resistance.

Key wordsDeer penis；Hydrolysate；Enzymatic hydrolysis；Active peptides

鹿鞭為鹿科動(dòng)物馬鹿或梅花鹿的陰莖和睪丸，具有補(bǔ)腎精、壯腎陽、益精和強(qiáng)腰膝等功效，主治腎虛勞損、腰膝酸痛、遺精早泄、耳聾耳鳴、陽痿等疾病。鹿鞭藥用已近有3 000年歷史，最早見于《名醫(yī)別錄》《日華子本草》《醫(yī)林纂要》等醫(yī)藥古籍，明代《本草綱目》記載詳細(xì)，現(xiàn)廣泛收載于地方藥品標(biāo)準(zhǔn)中，1991年收入部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]。

鹿鞭具有很好的藥效和滋補(bǔ)保健功能，并廣泛用于臨床，但對(duì)其藥理學(xué)研究相對(duì)匱乏，致使鹿鞭雖然常見于一些中藥方劑中，人們對(duì)其藥物作用機(jī)理并不十分清楚[2]。我國鹿鞭開發(fā)的制品多數(shù)是以保健酒形式存在，開發(fā)出的制品也比較簡單，存在深度開發(fā)和利用嚴(yán)重不足。研究表明，動(dòng)物藥材的功效源于其內(nèi)部所含有的生物活性成分，其生物活性成分可能主要是由氨基酸組成的活性肽[3]。因此，利用酶水解方法提取鹿鞭活性肽并研究其功效，能夠提高鹿鞭附加值，對(duì)鹿鞭的開發(fā)和利用具有重要意義。

該試驗(yàn)通過采用蛋白酶水解鹿鞭以獲得鹿鞭活性肽，分別選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶在最適條件下對(duì)鹿鞭進(jìn)行水解，通過對(duì)比其水解度（DH）以及鹿鞭活性肽還原能力、硫代巴比妥酸（TBARS）的抑制作用和DPPH自由基的清除率，從而優(yōu)選出最佳水解蛋白酶。

1材料與方法

1.1材料與主要試劑

馬鹿鞭購于吉林鑫鵬鹿場；堿性蛋白酶購于東恒華道公司，中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶購于Solarbio公司，胰蛋白酶購于Novo公司；DPPH自由基購于Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

梅特勒Delta 320型pH計(jì)、電熱恒溫水浴鍋LH 586-2、高速離心機(jī)TGL-16C、紫外可見分光光度計(jì)UV-2120 PSC、JD500-2型電子天平、精密增力電動(dòng)攪拌器JJ-1。

1.3研究方法

1.3.1鹿鞭的預(yù)處理。

取馬鹿鞭1 kg，去除包皮，剁成小塊（1 cm3左右），用預(yù)冷的蒸餾水（4 ℃）沖洗至無血色。絞碎膠體磨勻漿，離心收集沉淀，沉淀為粉碎的鹿鞭，放4 ℃冷室冷藏待用。

1.3.2最佳蛋白酶的篩選。

將鹿鞭殘?jiān)涑傻孜餄舛葹?%（W/W）的溶液，酶水解采用4種蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶），不同時(shí)間連續(xù)進(jìn)行水解，將4種蛋白酶與底物濃度比都設(shè)為2∶100，同時(shí)把酶反應(yīng)溫度和pH調(diào)節(jié)至各酶最佳反應(yīng)條件，反應(yīng)進(jìn)程中連續(xù)放入1 mol/L的NaOH，保持pH不變，并記錄耗堿量 （mL）、鹿鞭活性肽的水解度 （DH）。待結(jié)束酶水解后，在90 ℃水浴下5 min滅活，然后連續(xù)加入1 mol/L的HCl，將鹿鞭活性肽溶液pH調(diào)整為7.0，真空冷凍干燥鹿鞭活性肽溶液，在4 ℃下凍干保存鹿鞭活性肽樣品。將凍干的鹿鞭活性肽溶解成40 mg/mL的溶液，通過測定不同蛋白酶水解產(chǎn)生的鹿鞭活性肽的水解度、還原能力、對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化的抑制作用和DPPH自由基的清除率，從而篩選出最佳的蛋白酶。

1.3.3水解度的測定。

根據(jù)pH-Stat法[4]，水解度的計(jì)算公式為：

DH=hhtot×100%（1）

式（1）中，h為鹿鞭中被水解的肽鍵的量（mmol/g）。htot為鹿鞭中肽鍵的總量（mmol/g）。

其中：

h=B×Nb×1/α×1/Mt（2）

式（2）中，B為鹿鞭水解過程耗堿量（mL）；

Nb為堿液的濃度（mol/L）；

Mt為鹿鞭活性肽水解液中鹿鞭蛋白質(zhì)的量（g）；

1/α為校正系數(shù)。

1.3.4脂肪氧化體系 （Liposome）的制備。

參照改進(jìn)Decker等[5]的方法。將濃度為0.4 mg/mL大豆卵磷脂溶解在0.24 mol/L KCl溶液中，5 mmol/L組氨酸緩沖溶液 （pH 68）均質(zhì)后，在5 ℃溫度下超聲波降解溶液45 min。鹿鞭活性肽抗氧化活性的測定，分別準(zhǔn)備卵磷脂脂質(zhì)體10 mL與每個(gè)準(zhǔn)備測定的鹿鞭活性肽混合溶液2 mL進(jìn)行試驗(yàn)。用1 mL水與5 mL卵磷脂脂質(zhì)混合溶液作為陰性對(duì)照，0.02% BHA與5 mL卵磷脂脂質(zhì)混合溶液作為陽性對(duì)照。脂質(zhì)氧化是由鐵的氧化還原反應(yīng)所引起，將0.2 mL 25 mmol/L FeCl3 和0.2 mL 5 mmol/L 抗壞血酸鹽加入脂質(zhì)/蛋白溶液（6 mL）中。各待測溶液保持38 ℃溫度不變1 h，快速測定TBARS。

1.3.5亞鐵還原能力（FRAP）的測定。

采用Benzie等[6]的方法。取12.0 mL的FRAP （ferric reducing/antioxidant power）試劑，加熱到38 ℃，然后向其加入0.4 mL鹿鞭活性肽和1.2 mL H2O，反應(yīng)10 min，吸光度在分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至593 nm 波長進(jìn)行測定。同時(shí)做陰性對(duì)照和陽性對(duì)照進(jìn)行比較。以100、250、500、1 000 μmol/L FeSO4·7H2O繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4·7H2O（mmol/L）表示。

1.3.6DPPH自由基清除能力的測定。

采用Saiga等[7]的方法。取8 mL 1×10-4mol/L DPPH和甲醇混合溶液分別與不同酶水解產(chǎn)生的鹿鞭活性肽溶液2 mL同時(shí)放進(jìn)試管搖勻，常溫下避光反應(yīng)30 min。測量吸光度，在分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至517 nm波長下對(duì)照甲醇進(jìn)行測量。根據(jù)下列公式計(jì)算不同水解液對(duì)DPPH自由基的清除率：

清除率=[1-（B1-B2）/B3]×100%

式中，B1的吸光度是DPPH-鹿鞭活性肽混合溶液；

B2的吸光度是鹿鞭活性肽溶液；

B3的吸光度是未加鹿鞭活性肽時(shí)DPPH溶液。

2結(jié)果與分析

2.1不同蛋白酶不同水解時(shí)間的鹿鞭活性肽的水解度（DH）變化

從圖1可以看出，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的延長，不同蛋白酶水解鹿鞭產(chǎn)生的鹿鞭活性肽水解度曲線變化明顯，鹿鞭活性肽水解度曲線在8 h以后上升趨勢(shì)開始變得緩慢；而采用堿性蛋白酶水解所制造出的鹿鞭活性肽水解度變化明顯高于其他3種蛋白酶水解所產(chǎn)生的鹿鞭活性肽，且差異顯著（P<0.05）。

2.2鹿鞭活性肽對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化的抑制作用

從圖2可以看出，總體上來說，不同蛋白酶水解鹿鞭后所產(chǎn)生的鹿鞭活性肽都具有在卵磷脂脂質(zhì)氧化體系中抑制TBARS 的作用（P<0.05），然而在整個(gè)水解的過程中，經(jīng)堿性蛋白酶水解所獲得的鹿鞭活性肽抑制TBARS作用明顯高于其他3種蛋白酶水解所產(chǎn)生的鹿鞭活性肽。

2.3鹿鞭活性肽還原能力的測定

從圖3可以看出，鹿鞭通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶分別水解以后產(chǎn)生鹿鞭活性肽，全是隨著反應(yīng)時(shí)間的持續(xù)增加其還原能力得到加強(qiáng)，而通過堿性蛋白酶水解鹿鞭生成的鹿鞭活性肽的還原能力明顯高于其他3種蛋白酶水解所生成的鹿鞭活性肽，且差異顯著（P<0.05）。鹿鞭活性肽具有較高的還原能力是因?yàn)槁贡拊诿杆鈺r(shí)肽鏈會(huì)發(fā)生斷裂可以有效地增加氫離子數(shù)量。

2.4鹿鞭活性肽對(duì)DPPH自由基清除能力的測定可以看出，鹿鞭通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶分別水解以后，隨著水解時(shí)間的增加，其生成的鹿鞭活性肽清除DPPH自由基的效果與還原能力同樣得到加強(qiáng)。通過堿性蛋白酶水解比中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶水解產(chǎn)生的鹿鞭活性肽有更高的清除DPPH自由基作用，且差異顯著（P<0.05）。鹿鞭活性肽具有自由基清除能力，是因?yàn)槁贡藁钚噪闹邪猩彼帷⒘涟彼岷唾嚢彼岬劝被釟埢哂休^強(qiáng)的抗氧化能力。

3結(jié)論

該試驗(yàn)通過使用4種不同蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶）在最適條件下水解鹿鞭，研究鹿鞭活性肽的水解度和抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶水解鹿鞭產(chǎn)物鹿鞭活性肽水解度、抑制TBARS的作用、還原能力和對(duì)DPPH自由基的清除率都為最高。鹿鞭活性肽抗氧化性的產(chǎn)生是由于蛋白質(zhì)經(jīng)過水解使蛋白質(zhì)分解成特殊肽和氨基酸殘基成分，因而使其具有了抗氧化性；其抗氧化作用模式主要是通過終止自由基的產(chǎn)生能力，以及提供氫離子以起到還原作用的能力共同實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡雅妮，李峰，康延國.鹿鞭的生藥學(xué)研究進(jìn)展[J].中草藥，2003，34（7）：12-14.

[2] 李峰.鹿鞭的生藥學(xué)研究[D].沈陽：遼寧中醫(yī)學(xué)院，2004.

[3] 王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：1093-1102.

[4] ADLERNISSEN J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].London：Elsevier Applied Science Publishers，1986.

[5] DECKER E A，IVANOV V，ZHU B Z，et al.Inhibition of lowdensity lipoprotein oxidation by carnosine and histidine[J].Journal of agricultural and food chemistry，2001，49（1）：511-516.

[6] BENZIE I F F，STRAIN J J.The ferric reducing ability of plasma （FRAP）as a measure of “antioxidant power”：The FRAP assay[J].Analytical biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[7] SAIGA A，TANABE S，NISHIMURA T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment[J].Journal of agricultural and food chemistry，2003，51（12）：3661-3667.