龍膽草抗氧化活性和總黃酮含量測(cè)定研究

李培源 霍麗妮 賈智若 盧澄生

摘要 [目的]探討龍膽草3種提取物的抗氧化活性，并測(cè)定其總黃酮含量，研究其抗氧化活性和總黃酮含量之間的關(guān)系。[方法]采用乙醇、丙酮和乙酸乙酯3種溶劑，得到龍膽草3種提取物。采用DPPH自由基體系、還原能力體系評(píng)估提取物的抗氧化能力，測(cè)定其總黃酮含量，并探討其抗氧化活性-總黃酮含量之間的關(guān)系。[結(jié)果]龍膽草提取物具有優(yōu)異的抗氧化性能，總黃酮含量高的提取物具有更強(qiáng)的抗氧化能力。[結(jié)論]龍膽草可作為潛在的天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞 龍膽草；DPPH；還原能力；抗氧化；總黃酮含量

中圖分類號(hào) R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）31-0182-02

Abstract [Objective]To study the total flavonoid content and antioxidant activity of several extracts of Gentiana rigescens.[Methods]Three kinds of extracts of Gentiana rigescens were obtained by using three solvents of ethanol， acetone and ethyl acetate.The DPPH free radical system and reducing power system were used to evaluate the antioxidant capacity of the extract， and the total flavonoid content was determined， and the relationship between its antioxidant activity and total flavonoid content was discussed.[Result]The extract of Gentiana rigescens had excellent antioxidant properties， and the extract with high total flavonoid content had stronger antioxidant capacity.[Conclusion]Gentiana rigescens can be developed and utilized as a potential natural antioxidant.

Key words Gentiana rigescens；DPPH；Reducing power；Antioxidant；Total flavoniod

龍膽草（Gentiana rigescens）是龍膽科龍膽屬植物，多年生草本，高30～60 cm，生于山坡草地、路邊、河灘、灌叢中、林緣及林下、草甸，海拔400～1 700 m[1]，清熱燥濕、瀉肝膽火，可治濕熱黃疸、陰腫陰癢、帶下、強(qiáng)中、濕疹瘙癢、目赤、耳聾、脅痛、口苦、驚風(fēng)抽搐。龍膽草在民間使用非常廣泛，但其抗氧化方面的研究鮮見報(bào)道。近年來，尋找來源于植物的天然抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)[2-6]。筆者通過測(cè)定龍膽草3種溶劑提取物（乙醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物）對(duì)DPPH自由基的清除能力和還原能力來對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行研究，為龍膽草作為一種天然高效抗氧化物推廣利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

UV1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析電子科技有限公司）。龍膽草采于廣西百色，由廣西中醫(yī)學(xué)院壯藥學(xué)院韋松基教授鑒定為龍膽科龍膽屬植物龍膽草（Gentiana rigescens）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司（北京）。所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 龍膽草不同溶劑提取物制備。

稱取20 g龍膽草粉末，加入200 mL乙醇（95%），冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到龍膽草乙醇提取物（EE）0.7 g，得率為3.5%。同法，用丙酮及乙酸乙酯提取，得到丙酮提取物（AE）0.9 g和乙酸乙酯提取物（EAE）0.8 g，得率分別為4.5%和4.0%。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（l mg/mL）0.1 mL于10 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6 min，加入5%硝酸鋁0.4 mL，靜置6 min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。靜置15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.2.2 龍膽草提取物總黃酮含量測(cè)定。

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同“1.2.2.1”操作測(cè)定吸光度，多次測(cè)量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量（mg）表示，并計(jì)算提取得率。

1.2.3 二苯基苦味肼基自由基（DPPH）體系[7]。

取不同濃度龍膽草提取物溶液（0.2、0.5、0.8、1.2 mg/mL）加入8 mL DPPH（0.004%）溶液中。在最大波長(zhǎng)處（517 nm）測(cè)吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式為S =（1-A樣品）/A空白×100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 還原能力測(cè)定[8]。

取龍膽草提取物溶液，加入2.5 mL PBS溶液（pH=7.4）、2.5 mL KFe（CN）4（1%）。上述混合物于50 ℃恒溫20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%），離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL FeCl3（1%），混勻。在700 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為參比。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍膽草提取物總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

以吸光度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：y=9.677 8x+0.016 7（R2=0.999 2）。根據(jù)線性方程計(jì)算出龍膽草乙醇提取物﹙EE﹚、丙酮取物﹙AE ﹚和乙酸乙酯提取物﹙EAE﹚的總黃酮含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍膽草3種提取物均具有較高的總黃酮含量，其黃酮含量由高到低的順序?yàn)镋AE、AE、EE。AE和EAE的黃酮含量分別為51.6和58.9 mg/g，高于EE（21.2 mg/g）。

2.2 龍膽草提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

從龍膽草3種溶劑提取物（AE、EE、EAE）對(duì)DPPH自由基清除能力（圖1）可以看出，AE、EE、EAE對(duì)DPPH自由基的清除率隨提取物濃度增加而增大。EAE在濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為56.0%和61.5%；當(dāng)EAE濃度增加至1.2和1.5 mg/mL時(shí)清除率增大為72.0%和73.9%；當(dāng)EAE濃度增加至2.0 mg/mL時(shí)，清除率增大至79.7%。

在3種溶劑提取物中，AE在不同濃度下均表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力；在濃度為0.8 mg/mL時(shí)AE對(duì)DPPH自由基的清除率為72.2%，在濃度為1.2 mg/mL時(shí)清除率為75.2%，濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為80.4%。AE在低溶液濃度下具有良好的DPPH自由基清除能力，在濃度僅為0.5 mg/mL時(shí)，AE對(duì)DPPH自由基的清除率也達(dá)到了67.8%。EAE在濃度為0.5 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率約為55.0%，隨著濃度增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率顯著增加。在較低溶液濃度下（0.5 mg/mL），3種溶劑提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的順序?yàn)锳E>EAE>EE，在較高溶液濃度下，其對(duì)DPPH自由基清除能力的順序?yàn)锳E>EE>EAE。

2.3 不同溶劑提取物EC50值

半抑制濃度（EC50）表示抗氧化劑對(duì)自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的質(zhì)量濃度，因此，EC50的數(shù)值越小，則表明抗氧化劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。龍膽草3種提取物對(duì)DPPH自由基均表現(xiàn)出較低的EC50值，EE、AE和EAE對(duì)DPPH自由基的EC50值分別為0.45、0.01和0.12 mg/mL，對(duì)DPPH自由基均具有良好的清除效果。值得指出的是，AE對(duì)DPPH自由基的EC50值低至0.01 mg/mL，表明其對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)異。

2.4 龍膽草提取物的還原能力

從圖2可看出，在較低濃度下（0.5 mg/mL）下龍膽草3種溶劑提取物的還原能力相似，EAE、AE和EE的吸光度分別為0.35、0.32和0.31；同時(shí)，3種溶劑提取物的還原能力均與其濃度相關(guān)，隨提取物濃度增加而增大。對(duì)于AE，濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)吸光度分別為0.32和0.36，濃度為1.0和1.2 mg/mL時(shí)吸光度分別為0.40和0.46，當(dāng)AE濃度為2.0 mg/mL時(shí)吸光度為0.78。3種提取物中，EAE的還原能力最強(qiáng)，濃度為0.8 mg/mL時(shí)吸光度為0.50，濃度為1.5 mg/mL時(shí)吸光度為0.79。在最高濃度2.0 mg/mL時(shí)EAE吸光度達(dá)到0.84，而EE的還原能力最低，吸光度為0.55。可見具有較高總黃酮含量的AE和EAE均表現(xiàn)出很強(qiáng)的還原能力，表明龍膽草提取物的還原能力與總黃酮含量有關(guān)。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)測(cè)定了龍膽科龍膽屬植物龍膽草不同溶劑提取物的總黃酮含量，并通過DPPH自由基體系和還原能力來研究其抗氧化性能。結(jié)果表明，龍膽草不同溶劑提取物都具有較高的總黃酮含量，其中AE和EAE的總黃酮含量較高，分別為51.6和58.9 mg/g。3種溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均顯現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，AE在濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為80.4%，在濃度僅為0.5 mg/mL時(shí)，AE對(duì)DPPH自由基的清除率也達(dá)到了67.8%。同時(shí)，龍膽草提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，還原能力順序?yàn)镋AE>AE>EE，該順序與提取物總黃酮含量順序一致，表明其優(yōu)異的抗氧化能力與總黃酮含量有關(guān)。龍膽草不同溶劑提取物具有優(yōu)良的清除自由基能力和抗氧化能力，具有作為天然抗氧化劑應(yīng)用于各領(lǐng)域的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1988：104.

[2] HUANG B，BAN X Q，HE J S，et.al.Hepatoprotective and antioxidant activity of ethanolic extracts of edible lotus（Nelumbo nucifera Gaertn.）leaves[J].Food chemistry，2010，120（3）：873-878.

[3] ACOSTAMONTOYA ，VAILLANT F，COZZANO S，et al.Phenolic content and antioxidant capacity of tropical highland blackberry（Rubus adenotrichus Schltdl.）during three edible maturity stages[J].Food chemistry，2010，119（4）：1497-1501.

[4] ZHANG J，SHEN Q，LU J C，et.al.Phenolic compounds from the leaves of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinskaja and their inhibitory activity against PTP1B[J].Food chemistry，2010，119（4）：1491-1496.

[5] SU W，LI P Y，HUO L N，et al.Phenolic content and antioxidant activity of Phymatopteris hastate[J].J Serb Chem Soc，201 76（11）：1485-1496.

[6] TABART J，KEVERS C，PINCEMAIL J，et al.Antioxidant capacity of black currant varies with organ，season，and cultivar [J].J Agric Food Chem，2006，54（17）：6271-6276.

[7] LI P Y，HUO L N，SU W，et al.Free radicalscavenging capacity，antioxidant activity and phenolic content of Pouzolzia zeylanica[J].J Serb Chem Soc，201 76（5）：709-717.

[8] MAZOR D，GREENBERG L，SHAMIR D，et al.Antioxidant properties of bucillamine：Possible mode of action [J].Biochem Bioph Res Co，2006，349（3）：1171-1175.