高唐栝樓莖尖分生組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

彭向前　李光勇　劉輝

摘要[目的]采用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)培育高唐栝樓的脫病毒試管苗。[方法]對(duì)添加不同濃度外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列優(yōu)化試驗(yàn)，篩選出高唐栝樓脫毒試管苗最佳繁殖培養(yǎng)基。[結(jié)果]在MS+2.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果較好，技術(shù)上達(dá)到了快速繁殖規(guī)模生產(chǎn)的要求。經(jīng)反復(fù)的病毒檢測(cè)，證明脫毒試管苗脫病毒徹底。[結(jié)論]最終獲得了高唐栝樓莖尖培養(yǎng)脫毒與誘導(dǎo)、增殖和生根的培養(yǎng)基，及其生長(zhǎng)所需要的外部環(huán)境條件和相關(guān)配套技術(shù)。

關(guān)鍵詞高唐栝樓；脫毒；莖尖分生組織；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類(lèi)號(hào)S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0081-03

Technology System for Stemapex Meristem Culture and Rapid Propagation of Trichosanthes kirilowii Maxim.

PENG Xiangqian，LI Guangyong，LIU Hui et al

（College of Pharmaceutical Sciences，Liaocheng University，Liaocheng，Shandong 252059）

Abstract[Objective]Virusfree seedling in test tube of Trichosanthes kirilowii Maxim. was obtained from stemapex meristem culture in vitro. [Method]A series of optimization experiments for propagative medium composition and concentration of phytohormones were investigated with a view to accelerate the propagation of virusfree seedling in test tube of T. kirilowii Maxim. [Result]The most suitable rapid propagative medium of T. kirilowii Maxim. was MS+2.0 mg/L 6BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT. These results could meet the technology requirements of rapid propagation in large scale production. Virusfree seedlings in test tube were tested repeatedly，which had no virus completely. [Conclusion]The cultural mediums of detoxification and induction，proliferation and rooting were obtained as well as the external environmental conditions for the plant growth and matching technology.

Key wordsTrichosanthes kirilowii Maxim.；Virusfree；Stemapex meristem；Tissue culture；Rapid propagation

高唐栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）為葫蘆科栝樓屬多年生攀緣草本植物，有潤(rùn)肺化痰、養(yǎng)胃生津、利氣寬胸等作用[1]。高唐栝樓為山東省1種道地藥材，其個(gè)大質(zhì)優(yōu)，在國(guó)內(nèi)外享有較高的知名度，近年來(lái)面積不斷擴(kuò)大，而優(yōu)質(zhì)種苗卻供應(yīng)不足。栝樓繁殖一般有種子繁殖和分根繁殖2種方法，但栝樓雌雄異株，且開(kāi)花前無(wú)明顯的形態(tài)差異，難以分辨，種子繁殖后常出現(xiàn)雄株多（雌雄株比例約為 3∶7）的現(xiàn)象，影響了產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，而用分根繁殖，由于塊根本身屬于藥材，同時(shí)塊根繁殖量不大，且常年無(wú)性繁殖會(huì)引起種源退化嚴(yán)重，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)高唐栝樓種苗數(shù)量少[2]。

植物組織培養(yǎng)具有繁殖系數(shù)大、脫病毒復(fù)壯的優(yōu)點(diǎn)[3]，組織培養(yǎng)方法應(yīng)用在栝樓上已有報(bào)道，但有關(guān)高唐栝樓的組培研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者采用高唐栝樓塊根誘導(dǎo)產(chǎn)生幼芽，對(duì)幼芽的莖尖分生組織進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的高唐栝樓脫毒試管苗，不僅提高了高唐栝樓的繁殖系數(shù)，而且提高了高唐栝樓的產(chǎn)量與質(zhì)量。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品高唐栝樓，取株高唐栝樓根，并做好標(biāo)記。

1.2方法

1.2.1

供試材料處理。選取無(wú)病害且飽滿(mǎn)健壯的雌株高唐栝樓根，用自來(lái)水將其沖洗干凈后，埋于干凈的砂土中，保持良好的通風(fēng)環(huán)境，在（25±1）℃條件下進(jìn)行催芽。待高唐栝樓根上的幼芽高度達(dá)1.0～1.5 cm時(shí)剝?nèi)￠L(zhǎng)勢(shì)良好的幼芽，蒸餾水沖洗5次，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中處理5 min，進(jìn)行脫毒。

將脫毒的幼芽用無(wú)菌水沖洗后置于75%乙醇溶液30 s，置于5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，取出后用無(wú)菌水沖洗6次，置于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2培養(yǎng)基對(duì)莖尖成苗的影響。取高唐栝樓莖尖分別接種于MS、B5和LS這3種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽叢，3種培養(yǎng)基均不添加任何外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，計(jì)算成苗率，選擇培養(yǎng)基。

1.2.3

莖尖大小和成活率關(guān)系。剝?nèi)〔煌L(zhǎng)度高唐栝樓莖，分別接種到初代培養(yǎng)基MS+ 0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，莖尖明顯變綠說(shuō)明已經(jīng)成活，比較莖尖大小和成活率的關(guān)系。

1.2.4

初代培養(yǎng)。配制初代培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，分裝于培養(yǎng)瓶后進(jìn)行滅菌處理。取備用幼芽，借助解剖鏡剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖作為組織培養(yǎng)的外植體，每瓶接種1個(gè)，用玻璃紙包扎好瓶口，置于人工氣候室，培養(yǎng)環(huán)境為光照強(qiáng)度1 500 lx，溫度（25±1）℃，光照時(shí)間12 h/d，并設(shè)置暗時(shí)溫度（18±1）℃。培養(yǎng)7 d后，觀察培養(yǎng)的莖尖明顯膨大，呈淺黃色，莖尖隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)逐漸轉(zhuǎn)綠，20 d后莖尖呈翠綠色。

1.2.5

繼一代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)20 d后就可以準(zhǔn)備進(jìn)行繼一代培養(yǎng)，誘導(dǎo)高唐栝樓幼芽分化，形成芽叢。在第25 天進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼一代培養(yǎng)的培養(yǎng)基、光照和溫度等培養(yǎng)條件采用初代培養(yǎng)的條件。第45天大多數(shù)的幼芽高度可達(dá)2～3 cm，切下芽叢進(jìn)行繼二代培養(yǎng)。

1.2.6

病毒檢測(cè)。從繼一代培養(yǎng)的芽叢上選擇1個(gè)幼芽，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)其進(jìn)行病毒檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，選擇已完全脫去病毒的芽叢進(jìn)行繼二代培養(yǎng)。

1.2.7

繼二代培養(yǎng)和繁殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。高唐栝樓繼一代培養(yǎng)幼芽進(jìn)行繼二代培養(yǎng)后，觀察到采用初始培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗比較瘦弱，且易玻璃化，因此，對(duì)繁殖培養(yǎng)基的配比進(jìn)行優(yōu)化篩選。采用正交試驗(yàn)L9（34），探討6-BA、NAA、KT這3種外源外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)培養(yǎng)效果的影響（表1）。

1.2.8

生根與煉苗。取高約1.5 cm的試管苗接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，生根培養(yǎng)基等同于初代培養(yǎng)基。7 d后試管苗開(kāi)始生根，待試管苗高度為5～6 cm、根為3～5條時(shí)，揭蓋煉苗，控制溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度90%以上。為防止幼苗失水，在培養(yǎng)瓶中加少許清水，第1～3天瓶蓋半開(kāi)半遮，第4天完全去掉瓶蓋。

1.2.9

移栽馴化。將煉苗后的試管苗取出，用清水沖去根上附著的培養(yǎng)基，用多靈1 000倍液蘸根，移栽到營(yíng)養(yǎng)缽，置于戶(hù)外簡(jiǎn)易人工氣候室苗床中進(jìn)行馴化，第1～7天控制溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度90%以上，第7天后，控制溫度在20～30 ℃，并逐漸加大通風(fēng)量，降低濕度，同時(shí)增加自然光照強(qiáng)度和時(shí)間，使高唐栝樓幼苗逐漸適應(yīng)自然環(huán)境。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖成苗的影響

取高唐栝樓莖尖分別接種于MS、B5和LS這3種培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽叢，3種培養(yǎng)基中均不添加任何外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)表2。3種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)芽叢的產(chǎn)生，成苗率為85.0%以上。在MS培養(yǎng)基中成苗率較高，且芽叢健壯，B5和LS這2種培養(yǎng)基中的芽瘦弱，且成苗率相對(duì)較低。因此，選擇MS作為主要培養(yǎng)基。

2.2莖尖大小和成活率關(guān)系

取備用的高唐栝樓幼苗，剝?nèi)〔煌L(zhǎng)度的莖尖，分別接種到初始培養(yǎng)基，莖尖明顯變綠說(shuō)明莖尖已經(jīng)成活。莖尖大小和成活率的關(guān)系見(jiàn)表3。

高唐栝樓脫毒過(guò)程中，剝?nèi)〉那o尖大容易成活，但相應(yīng)的芽叢攜帶病毒的概率變大，達(dá)不到脫毒的效果；剝?nèi)〉那o尖小攜帶病毒的概率降低，但成活率不高，主要由于過(guò)小的莖尖頂端含有細(xì)胞數(shù)目少，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步分裂分化的可能性小[4]。

0.2 mm以下的莖尖容易干枯死亡，且成活率低。經(jīng)過(guò)比較莖尖大小和成活率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖分生組織培養(yǎng)可以取得較好的效果，因剝?nèi)〉那o尖相對(duì)較小，容易脫水死亡，所以剝?nèi)∏o尖動(dòng)作要迅速。

2.3繁殖培養(yǎng)基的篩選

從表4可以看出，3種外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)試管苗平均生長(zhǎng)率的影響大小為A（6-BA）、C（KT）、B（NAA）。A（6-BA）因素與試管苗生長(zhǎng)率有極顯著意義（P<001），C（KT）因素與試管苗生長(zhǎng)率有顯著意義（P<005），而B(niǎo)（NAA）因素與試管苗生長(zhǎng)率沒(méi)有顯著意義，在正交試驗(yàn)中9種培養(yǎng)基試管苗生長(zhǎng)率最高為50.2%。優(yōu)化篩選出高唐栝樓的最佳繁殖培養(yǎng)基為A2B1C3，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT，用篩選得到的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行高唐栝樓試管苗繼二代培養(yǎng)，試管苗比較健壯，沒(méi)有出現(xiàn)玻璃化苗，試管苗生長(zhǎng)率為60.5%。

2.4脫毒高唐栝樓苗的病毒檢測(cè)

對(duì)移栽馴化成活后的高唐栝樓脫毒苗進(jìn)行病毒檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)隨機(jī)取樣，采集葉片1 g置于研缽中，加入10 mL水和5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L）研磨，取液分別涂抹于葉片2～3次，用600目金鋼砂輕輕磨擦，5 min后用清水沖洗葉面，30 d后觀察葉片的發(fā)病情況[5]。檢測(cè)結(jié)果顯示，高唐栝樓脫毒苗的脫毒率為100%。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以高唐栝樓莖尖作為外植體，采用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)，不經(jīng)歷愈傷組織，一次性成苗，比經(jīng)歷愈傷組織后再轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基生根發(fā)芽要快，還不會(huì)出現(xiàn)遺傳上的不穩(wěn)定性和變異性，同時(shí)還能簡(jiǎn)化育苗程序[6]，降低生產(chǎn)成本。該試驗(yàn)通過(guò)高唐栝樓莖尖組織培養(yǎng)，建立了高唐栝樓快速繁殖體系，解決了高唐栝樓以種子繁育雌雄比例不協(xié)調(diào)的問(wèn)題，可大量提供優(yōu)質(zhì)高唐栝樓組培苗，降低繁育成本，加速優(yōu)質(zhì)種苗的繁育進(jìn)程[7]，同時(shí)對(duì)高唐栝樓種苗的品種更新及品種遺傳改良具有一定的指導(dǎo)意義。

外植體能否再生成功，在很大程度上取決于所選植物的基因型對(duì)培養(yǎng)基的適合程度。在培養(yǎng)基的選擇上，加入微量外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖尖分生組織發(fā)育有促進(jìn)作用，可明顯提高高唐栝樓莖尖的成活率，但高濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)芽叢的誘導(dǎo)有利，同時(shí)會(huì)抑制植物本身生長(zhǎng)素的產(chǎn)生，這樣植株葉綠素等成分合成無(wú)法跟上植物細(xì)胞分裂的速度，會(huì)產(chǎn)生黃綠色略透明的玻璃化苗[8]。該研究在比較MS、B5、LS這3種培養(yǎng)基對(duì)莖尖成苗影響的基礎(chǔ)上確定了MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以較低濃度的6-BA、NAA和KT這3種外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同配比加入到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行正交試驗(yàn)，最后篩選出的培養(yǎng)基得到了較好的培養(yǎng)效果。正交試驗(yàn)方差分析表明，6-BA和KT這2種外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入培養(yǎng)基對(duì)試管苗生長(zhǎng)率的影響比較大，這表明不同基因型的植物對(duì)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的敏感程度是不相同的，所以在培養(yǎng)基中加入外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)要有一定的選擇性。

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