纖維素高效分解復合菌系篩選及分解特性研究

程玥晴 聶銘 陳霞 江滔 謝永紅

摘? ?要? ?以小麥秸稈纖維素為主要原料，在纖維素分解過程中，通過繼代轉接，篩選和馴化了一組高效而穩定的纖維素高效腐解菌系CMS-3。篩選出的復合菌系在50 ℃，靜止培養條件下，在第7天可使未經任何處理的麥秸的分解率達到73%，其中纖維素、半纖維素的分解率分別為67%、75%，而對木質素的分解能力很低。復合菌系CMS-3經過多次繼代篩選和培養，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩定性。復合菌系CMS-3中的菌種主要由隸屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成，菌群結構穩定。

關鍵詞? ?秸稈纖維素;分解特性;高效腐解菌系;CMS-3

中圖分類號：Q946;S182? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.007

目前已有很多關于纖維素分解菌的報道，大部分都是以純培養方法獲得的，但單一菌株對天然纖維質成分的農業廢棄物的分解能力很有限，近年來的一些研究表明，混合菌群對天然纖維質的分解能力明顯高于單一菌株。本課題組在以小麥秸稈為主要原料的分解過程中，在不破壞微生物之間協同關系的條件下，篩選和馴化了一組高效而穩定的纖維素高效腐解菌系CMS-3，系統研究了該菌群的纖維素分解特性和穩定性，以及微生物種類構成。

1 材料與方法

1.1 培養條件

培養基：蛋白胨纖維素培養液（PCS），其成分為0.5%蛋白胨、0.5%麥稈粉、0.5%NaCl、0.2%CaCO3、0.1%酵母粉，在50 ℃靜止培養，溶解氧DO值為0.02～0.40。

1.2 纖維素分解菌復合系CMS-3的篩選及馴化

分別用“麥秸+豬糞”“麥秸+雞糞”“麥秸+牛糞”混合成C/N為25，含水量為65%的基質后堆積發酵。堆肥采用條垛翻堆系統，翻堆頻率為每周2次，在堆肥CO2排放速率和凈重減少率最大時間段取樣。分別從各堆體取20 g樣接種于100 mL PCS中，50 ℃靜止培養;待浸在培養液中的麥秸呈糊狀開始分解斷裂時，轉接于同樣的新鮮培養液中。如此分別轉接數代后，將pH檢測反應偏酸和偏堿的培養物混合接種，在傳代過程中篩選出麥秸分解速度快而且pH保持穩定的復合體，最終馴化成高效且穩定的復合系CMS-3。

1.3 纖維素分解活性的測定

1）CMC糖化法。將培養液直接以3 000 r·min-1離心15 min后提取粗酶液。酶促反應溫度為60 ℃，反應時間為5 min，DNS顯色反應時間5 min，測定波長為490 nm。

2）減重法。將1 g的濾紙作為唯一碳源配制100 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養72 h后，5 000 r·min-1離心，倒上清液，用鹽酸和硝酸的混合液沖洗以消除菌體，離心，清水洗，再離心，最后105 ℃烘干后稱重，計算失重量和失重率。

1.4 CMS-3對不同纖維素材料的分解能力

分別取1 g的濾紙、未經處理的麥稈和鋸末作為唯一碳源，配制200 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養72 h后，用失重法測定分解能力。

1.5 連續培養條件下CMS-3發酵液的pH和纖維素分解能力的穩定性

在2 000 mL三角瓶中裝1 500 mL PCS，每瓶加3 g麥秸，不調pH值。分2組：一組不再供應新的麥秸，在50 ℃下繼續培養，每天測定1次培養液的pH值;另一組在第1次供應的麥秸大部分分解時開始每天追加1.5 g麥秸，每天測定1次pH值，并觀察麥秸的分解情況。

1.6 麥秸殘留中纖維素、半纖維素和木質素含量的測定

取1 g小麥秸稈作為唯一碳源，配制190 mL PCS，接種10 mL CMS-3菌液，50 ℃靜止培養20 d。共設20個重復，分別在第0， 7， 15， 20天取樣，每個時間點取3個重復樣品。將烘干后的秸稈殘渣粉碎，過1 mm的篩子，稱取0.2～0.5 g裝入濾袋，3個重復，采用范式洗滌法[1]測定秸稈的可溶性物質、纖維素、半纖維素和木質素。

1.7 發酵液中可溶性糖的測定

蒽酮比色法，設3次重復。

1.8 復合菌系CMS-3種類組成分析

取復合菌系CMS-3對麥秸不同發酵天數（3， 7， 10， 15， 20 d）的發酵液。用氯苯法提取每個處理樣品的總DNA，用變性梯度膠電泳（DGGE）法比較不同發酵天數的16S rDNA條帶，分析菌種構成。用于DGGE分析的PCR擴增區域為16S rDNA的V3區。所采用的引物為細菌通用引物對357F-GC5′-CGCCCG-CCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）。反應程序為95 ℃預變性10 min，前10個循環：93 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;接下來10個循環：93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后10個循環：93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;產物最終72 ℃延伸5 min。擴增產物用2%瓊脂糖膠檢測。DGGE回收條帶檢測所用PCR引物為357F和517R，退火溫度為50 ℃，循環數為25，其余同上。PCR產物用于DGGE分析。從雙變性梯度凝膠上回收16S rDNA的V3區條帶，再擴增、濃縮后進行堿基序列分析，擴增引物為357F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCG-GCTGCTGG-3′）。登錄GenBank數據庫，對堿基序列進行BLAST比對，根據親緣關系進行相似性分析。

2 結果與分析

2.1 CMS-3的篩選與馴化

3種堆肥樣品中均得到有較強纖維素分解能力的培養物。其中，“麥秸+牛糞”（編號為A）的培養物麥秸分解速度最快，經168 h后相當于培養物1.0%的麥秸大部分被分解，其后依次為“麥秸+豬糞”（B）、“麥秸+雞糞（C）”的培養物（見表1）。但隨著傳代次數的增加，它們的纖維素分解速度變慢，發酵液的pH值也不穩定，在三種堆肥樣品培養物中B和C發酵液逐漸趨于微酸性，A發酵液逐漸趨于微堿性，最終停止反應。將A， B， C三種發酵液互相混合接種，得到1組麥秸分解速度144 h的混合體。經多次的傳代、馴化，混合體在發酵過程中的pH值已穩定在6.5左右，并在2 L的培養規模上連續投放麥秸的情況下分解活性保持1個月以上。此混合體即為含多種纖維素分解菌的高效而穩定的纖維素分解菌復合系（編號為CMS-3）。

2.2 CMS-3分解麥秸的纖維素酶活性及分解率

在含有1 g濾紙的200 mL PCS中，接CMS-3菌液10 mL，50 ℃靜止培養，第48， 72， 96 h用CMC糖化力法分別測定纖維素酶活。結果酶活性分別為101.8±2.6， 97.5±1.4， 90.2±0.5 U·mL-1，第48 h的活性最高。在實際觀察時，第48 h紙片變膨松，第72 h紙片大部分區域崩解，第96 h已完全崩解，說明最高的酶活性出現在外觀上紙片變膨松的初期。第96 h用失重法測定結果，1 g濾紙失重0.83 g，分解率為83%。失重法能比較真實地反映該復合系的纖維分解能力。

2.3 CMS-3對不同纖維素材料分解能力的比較

用失重法測定CMS-3對濾紙、麥稈粉及鋸末的分解率。其中，對濾紙的分解率最高，在96 h內200 mL培養液中1 g濾紙幾乎全部被分解，分解率為（90±0.3）%;對麥秸、鋸末的分解率分別為（73±0.2）%、（12±0.4）%。由此可見，CMS-3對含較純木質纖維素的濾紙有很強的分解能力，對結構復雜木質纖維素的麥秸也有較強的分解能力，而對木質素含量較高的鋸末分解能力很有限。

2.4 在連續培養條件下CMS-3發酵液pH和對纖維素分解能力的穩定性

未調pH的2瓶PCS培養液（A和B瓶）滅菌后的pH值為8.2和8.1。接種CMS-3培養48 h后，兩者的pH值下降到6.3和6.4，在48～96 h維持同樣pH并將3 g麥秸大部分分解;隨后，A瓶的pH值就上升，到第7天穩定在8.2左右（見圖1），此水平能維持30 d。B瓶在麥秸大部分被分解時（第7天）開始每天連續投放1.5 g麥秸，結果前20 d不僅投放的麥秸大部分分解，其pH值還一直穩定在6.2～6.4。這說明CMS-3的生長和纖維素分解功能相當穩定。

2.5 CMS-3分解麥秸過程中可溶性物質、纖維素、半纖維素和木質素的含量

CMS-3分解麥秸過程中可溶性物質、纖維素、半纖維素和木質素的含量見圖2?？梢钥闯觯珻MS-3對小麥秸稈具有較強的分解能力，在第7天時，纖維素、半纖維素的分解率達67%和75%，木質素的分解率僅為5.4%;在第15天和20天，纖維素、半纖維素和木質素的分解率均略有降低。由此可知，CMS-3對小麥秸稈在第7天可完成大部分的分解，且主要分解半纖維素、纖維素，而對木質素的分解能力很低。

2.6 CMS-3分解麥秸過程中可溶性糖的含量

CMS-3分解麥秸過程中，0， 7， 15， 20 d可溶性糖的含量分別為0.16±0.04， 0.07±0.005， 0.055±0.004， 0.050±0.003 mg·mL-1?？梢姡囵B體系的可溶性糖從開始的較高水平一直下降，且在第7天時可溶性糖的下降幅度最大，秸稈分解率與分解體系的可溶性糖的積累量呈負相關。

2.7 復合菌系CMS-3種類的組成

復合菌系CMS-3在分解麥秸過程中各時間點的16S rDNA條帶PCR的變性梯度膠電泳（DGGE）結果見圖3，菌系種類組成見表2。由圖3可知，不同時間點的DGGE主要條帶變化不大，這說明該復合菌系在分解麥秸過程中菌種組成穩定。由表2可知，該復合菌系有好氧的芽孢桿菌屬、厭氧的梭菌屬和瘤胃桿菌屬。已有研究表明，這幾類菌種都與纖維素的分解有關，其中梭菌屬能牢牢地沾附在秸稈上，且能利用纖維二糖、木糖、葡萄糖和蔗糖產生乙酸、乳酸和H2。復合菌系CMS-3具有強分解麥秸的能力可能是上述幾類菌種協同作用的結果，其協同機理還有待進一步研究。

3 結論

從三種堆肥樣品中篩選出的復合菌系CMS-3在50 ℃，靜止培養條件下，在第7天可使未經任何處理的麥秸的分解率達到73%，其中纖維素、半纖維素的分解率分別為67%、75%，而對木質素的分解能力很低。與已有研究結果相比，該復合菌系的分解能力處于較高水平。

復合菌系CMS-3經過多次繼代篩選和培養，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩定性。復合菌系CMS-3中的菌種主要由隸屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成，其較強的麥秸分解能力可能是這幾類菌種的協同作用的結果。

復合菌系CMS-3作為農業纖維質固體廢棄物的高效腐解菌，在農業廢棄物處理利用中具有廣泛的應用前景。

參考文獻：

[1] 戴曉虎，于春曉，李寧，等.有機負荷對醋糟厭氧消化系統啟動的影響[J].環境科學，2017，38（3）：1144-1150.