重組單克隆抗體生產(chǎn)的宿主細(xì)胞系的研究進(jìn)展

劉素霞

摘要：許多表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)單克隆抗體，并且也在研究中。CHO細(xì)胞是最常用于研究的細(xì)胞系，直到今天仍然是單克隆抗體生產(chǎn)的主力。對(duì)宿主細(xì)胞系進(jìn)行改造提高產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量，不同的宿主細(xì)胞系生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異。

關(guān)鍵詞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢；單克隆抗體；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

1 歷史和科學(xué)背景

單克隆抗體（MonoclonalAntibody，mAb）在重組蛋白藥物中占比最大，不僅可以用于人類疾病的治療，還可用于多種疾病的體內(nèi)成像診斷。

20世紀(jì)60年代，人們開(kāi)始培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞，并且通過(guò)化學(xué)或輻射方法處理后建立了營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞株。1975年雜交瘤技術(shù)發(fā)表，制藥行業(yè)很快意識(shí)到mAb將成為重磅炸彈。OKT3是第一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的小鼠mAb，作用于人類T淋巴細(xì)胞，用于抑制腎移植手術(shù)后的異體排斥。

人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及體外翻譯系統(tǒng)已經(jīng)研究了數(shù)十年，這些生產(chǎn)系統(tǒng)主要的難點(diǎn)是產(chǎn)品效價(jià)不足，另外，轉(zhuǎn)基因植物常常存在多余的糖基化或蛋白水解活性，造成下游操作程序復(fù)雜、低效。

2 mAb生產(chǎn)的宿主細(xì)胞系

用于重組mAb表達(dá)的宿主細(xì)胞系主要是CHO，NS0，Sp2/0，HEK293和PER.C6。但是，被批準(zhǔn)用于人類治療mAbs生產(chǎn)的細(xì)胞系僅有CHO，NS0和Sp2/0。其中，CHO細(xì)胞占據(jù)了當(dāng)今工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的70%。[1]

1986年，首個(gè)重組生物藥tPA被批準(zhǔn)上市，CHO細(xì)胞作為其表達(dá)系統(tǒng)也成為重組蛋白表達(dá)的首選細(xì)胞系。目前，CHO細(xì)胞系的mAb生產(chǎn)工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，通常批次生產(chǎn)的產(chǎn)量最高可達(dá)到1 g/L，流加培養(yǎng)可達(dá)到110 g/L。[2]

鼠源細(xì)胞系的NS0和Sp2也可用于重組mAb生產(chǎn)，NS0細(xì)胞的細(xì)胞密度和mAb表達(dá)量通常會(huì)比CHO細(xì)胞的批次培養(yǎng)低10倍。HEK和PER.C6細(xì)胞可以表達(dá)與人類蛋白質(zhì)糖基化一致的mAb，HEK293細(xì)胞尤其適用于瞬時(shí)基因表達(dá)，可以在DNA轉(zhuǎn)染后幾天內(nèi)收獲蛋白質(zhì)。

3 mAb生產(chǎn)的宿主細(xì)胞工程

研究者們通過(guò)過(guò)量表達(dá)或敲除某個(gè)基因，調(diào)整代謝途徑、延緩細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)效率，有效的增加了重組蛋白產(chǎn)量。在重組 CHO 中表達(dá)酵母PYC2，可以改變流加培養(yǎng)方式中葡萄糖的代謝速率，增長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而增加細(xì)胞密度及產(chǎn)量。應(yīng)用鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶完全敲除CHO 細(xì)胞的Bak和Bax基因，IgG表達(dá)提高25倍。[3]

4 mAb生產(chǎn)中的“產(chǎn)品質(zhì)量”

在不同細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的mAb的一級(jí)序列主要由轉(zhuǎn)入基因的密碼子決定，但翻譯后修飾決定了重組蛋白質(zhì)的微觀不均一性，并對(duì)其溶解度，穩(wěn)定性，藥代動(dòng)力學(xué)，效力和生物活性具有顯著影響。

蛋白質(zhì)的糖基化可影響蛋白質(zhì)的藥理活性、生理生化特性以及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，半乳糖基化對(duì)于介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）是相當(dāng)重要的。α1，6巖藻糖基通過(guò)與FcγRIIIa受體的特異性抗體結(jié)合，從而在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）中起作用，CHO表達(dá)的mAb含有高達(dá)90%的巖藻糖化，通過(guò)基因工程改造使其缺乏α1，6巖藻糖基，可增加mAb的ADCC活性。唾液酸化有利于增加mAb的血清半衰期，但也有報(bào)道說(shuō)末端唾液酸會(huì)減少ADCC活性。[4]

將mAb應(yīng)用于體內(nèi)之前，需要嚴(yán)格控制產(chǎn)品的質(zhì)量，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、環(huán)境條件或生產(chǎn)過(guò)程等因素使得重組蛋白在生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生聚集，形成較大顆粒，若是治療性蛋白質(zhì)可能會(huì)因此失去生物活性，甚至出現(xiàn)免疫反應(yīng)或其他副作用。[5]

5 mAb生產(chǎn)的現(xiàn)有及先進(jìn)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在過(guò)去幾十年里已經(jīng)相當(dāng)成熟，并逐漸發(fā)展成為一種相對(duì)可靠和強(qiáng)大的技術(shù)。大約30年前，“老”生物過(guò)程通常以分批模式運(yùn)行一周，最大細(xì)胞濃度為3×106cells/ mL，重組蛋白產(chǎn)量約為100 mg/L。二十年后，由于改善了基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及補(bǔ)料策略，mAb表達(dá)量達(dá)到15g/L。現(xiàn)在，生產(chǎn)工藝得到進(jìn)一步的發(fā)展，產(chǎn)品表達(dá)量可以超過(guò)10 g/L。

物理參數(shù)（例如溫度，氣體流量），化學(xué)參數(shù)（例如pH，滲透壓，溶氧）和生物學(xué)參數(shù)（例如細(xì)胞密度，存活力，細(xì)胞周期）都會(huì)顯著影響產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率，特別是對(duì)產(chǎn)品的糖基化，翻譯后修飾水平和雜質(zhì)類型方面有顯著影響。要獲得符合質(zhì)量要求且產(chǎn)量高的mAb，培養(yǎng)操作參數(shù)的優(yōu)化是極其重要的。

6 結(jié)論

大約75%的科學(xué)出版物從一開(kāi)始就使用CHO細(xì)胞。因此，在接下來(lái)的幾十年中，CHO細(xì)胞可能仍然是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中蛋白質(zhì)表達(dá)的主力。與此同時(shí)，已經(jīng)開(kāi)展了許多替代表達(dá)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，特別是對(duì)于一些新形式或人工改造的mAb變體。只要它們能夠達(dá)到期望的質(zhì)量，甚至可以在低等真核生物或原核生物中表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Valente KN，Levy NE，Lee KH.Applications of proteomic methods for CHO host cell protein characterization in biopharmaceutical manufacturing.Curr Opin Biotechnol.2018，53：144150.

[2]Wang W，Zheng W，Hu F，et al.Enhanced Biosynthesis Performance of Heterologous Proteins in CHOK1 Cells Using CRISPRCas9.ACS Synth Biol.2018，7（5）：12591268.

[3]Toussaint C，Henry O，Durocher Y.Metabolic engineering of CHO cells to alter lactate metabolism during fedbatch cultures.J.Biotechnol，2015，217：122131.

[4]黃嘉慧，汪才坤，覃錦紅，等.N糖基化對(duì)TNFRFc融合蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性的影響.中國(guó)生物工程雜志，2016（5）：1219.

[5]李敏，常衛(wèi)紅.生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與建立一般原則的探討.中國(guó)新藥雜志，2017，26（16）：18871893.