Small RNA高通量測序文庫分選方法比較

張磊 張清華 杜安娜 閔娟 高丁

摘 要：對于常規small RNA測序，使用Bluepinpin全自動核酸電泳與片段回收系統對文庫進行回收，安全，目前已被廣大測序用戶采納，但費用相對較高；而傳統的切膠回收方法，其使用的實驗試劑對人體有危害，同時操作繁雜，耗時較長，但費用較低。作者發現某些特殊樣品構建的文庫使用兩種回收方法獲得的文庫差異懸殊，這篇文章旨在對特殊樣品的文庫使用全自動回收儀和傳統的切膠回收的方法進行比較。因此，在smallRNA文庫回收時，需根據不同的實驗材料與需求，選擇最優的回收方案。

關鍵詞：smallRNA；文庫回收；分選方法

隨著高通量測序的廣泛應用，對測序文庫質量的要求也越來越高，文庫片段大小的分選則是文庫制備中的關鍵步驟。傳統的核酸片段回收的方法是利用切膠回收，該方法比較繁瑣，且操作過程中使用到的部分試劑對人體有毒性。因此，自動化完成核酸片段回收的需求越來越強烈。Sage Science公司由此開發出了 Pippin Prep（Bluepinpin） 全自動核酸電泳與片段回收系統，高質量的完成包括建庫在內的多種實驗過程中分離純化各種大小 DNA 片段的需求。精確的片段回收對于優化高通量測序效率、提高基因組組裝成功率和降低測序運行成本均具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

Bluepinpin 全自動核酸電泳與片段回收系統（ Sage Science）、3% Agarose Gel Cassettes， Dye-free（ Sage Science） 、安捷倫2100生物分析儀、安捷倫High Sensitivity DNA Kit （ Agilent ）、Novex TBE gels， 6%， 10 well （ Life Technology ）、Novex TBE running buffer （ 5× ） （ Invitrogen ）。

1.2 樣品前處理

根據特定的實驗目的，對樣品進行前處理，將病毒接種細胞后進行分離培養，使用常規的方法提取病毒Total RNA，再加入相應的抗體、RNase、Proteinse K、酚、氯仿等一系列的處理，再使用無水乙醇/乙酸鈉/Glycogen沉淀，置于-80℃冰箱保存。

1.3 Small RNA文庫構建及回收

將沉淀下來的Total RNA用無酶水溶解，使用Illumina small RNA library prepare kit（ REF： 15016911），按照操作說明構建small RNA 文庫。對構建好的文庫分別進行切膠回收和使用Bluepinpin 全自動核酸電泳與片段回收系統進行回收。

1.4 對回收前和回收后的文庫進行質檢

利用qubit 3.0對構建好的文庫進行定量，再分別對使用兩種方法回收的文庫進行定量，比較兩種方法的回收效率。同時，使用安捷倫2100核酸檢測儀進行片段大小的檢測，以檢測回收的片段大小范圍是否符合實驗要求，并比較兩種方法對片段大小的分選能力。

2 結果與分析

對回收前和回收后的Small RNA文庫進行濃度檢測。使用qubit3.0檢測回收前，體積為30 uL，濃度為68.2 ng/uL；切膠回收后體積為30 uL，濃度為46.6 ng/uL，回收率為68.33%；使用Bluepinpin回收系統回收后體積為30 uL，濃度為1.58 ng/uL，回收率為2.32%。由此可見，兩種回收方法差異極為顯著。

對回收前和回收后的Small RNA文庫進行片段大小檢測。結果如右圖所示。（圖1、圖2、圖3）

結果顯示，切膠回收比使用Bluepinpin回收系統回收效果好，回收效率更高，片段分選更精確，且能達到上機測序的要求。

3 討論

對于該實驗中使用的測序建庫材料，由于其特殊的實驗目的，建庫前進行了相關的抗體處理，并在核酸溶解時加入糖原，這些抗體和糖原在建庫時被引入，并有可能一直存在于構建好的文庫中。而Bluepinpin回收系統回收時要求核酸中無任何蛋白、鹽離子等雜質，此文庫中存在的抗體和糖原可能嚴重的影響了Bluepinpin回收系統識別文庫中核酸片段大小的能力，從而導致回收效率低下，且片段大小雜亂無章，無法準確回收目的片段。因此，對于此類樣品，必須采用傳統的切膠方法回收方可回收到目的片段。

4 致謝

感謝中科院武漢病毒研究所公共技術服務中心張配和許碧超提供的實驗方面的幫助。