桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉抗氧化指標(biāo)及營養(yǎng)組成的影響

陳 冰，楊繼華,2，曹俊明，黃燕華，孫育平，王國霞

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共試驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點試驗室，廣州 510640；2.廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524094)

桑樹在我國廣泛種植，種植面積約100萬公頃，桑葉的年產(chǎn)量高達1 000萬噸，其含有多種營養(yǎng)成分和天然活性物質(zhì)。黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一，占桑葉干物質(zhì)的1%～3%[1]，具有抗腫瘤、降壓、降血糖、抗氧化、抗衰老等生理功能[2]。一些研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮化合物能顯著清除DPPH自由基，具有較強的抗氧化作用[3-4]。據(jù)報道，植物黃酮，如葛根總黃酮、槐屬植物黃酮，可以改善動物生長性能、抗氧化能力及肉品質(zhì)[5-6]。曲培濱[7]發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮對犢牛的生長、屠宰性能及肉品質(zhì)的提高有良好的效果；李法見等[8]指出，桑葉對羅非魚生長性能、脂質(zhì)代謝和肌肉品質(zhì)有促進作用。本實驗室早期研究結(jié)果表明，飼料中添加桑葉黃酮能夠顯著提高吉富羅非魚血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力[9]。目前，有關(guān)桑葉黃酮對水產(chǎn)動物肌肉抗氧化作用的研究未見報道。

羅非魚是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，隨著羅非魚集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各種氧化應(yīng)激因素不斷增加，造成羅非魚的抗氧化能力和抗病力下降。并且，抗生素類化學(xué)藥物的不規(guī)范使用，嚴(yán)重影響肉品質(zhì)及食用安全性。因此，利用天然植物生物活性物質(zhì)提高魚體的抗氧化性能，減少抗生素藥物的使用，改善肌肉品質(zhì)和安全性，對羅非魚健康養(yǎng)殖具有重要意義。因此，本試驗在前期關(guān)于生長性能和抗氧化能力研究[9]的基礎(chǔ)上，進一步研究了在飼料中添加不同水平的桑葉黃酮對吉富羅非魚(GIFT,Oreochromisniloticus)肌肉抗氧化性能和營養(yǎng)組成的影響,以便為桑葉黃酮在羅非魚飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加桑葉黃酮0、50、100、300、500、1 000 mg/kg(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工所提供，純度77.9%)，配制6種試驗飼料。配制飼料時，先將桑葉黃酮溶于水，再加入到各組飼料原料混合物中。各種原料經(jīng)粉碎后過60目篩，稱重后混勻，少量的成分采用逐級擴大法混合，用SLX-80型雙螺桿擠壓機(華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))、G-500型造粒機(華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，冷卻后放入密封袋中于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diet air-dry basis,%

注：1)每千克維生素預(yù)混料含有：VA 3 200 000 IU,VD31 600 000 IU,VE 16 g,VK 4 g,VB14 g,VB28 g,VB64.8 g,VB1216 mg,泛酸鈣16 g,葉酸1.28 g,生物素64 mg,煙酸 28 g,肌醇 40 g。
2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有：Mg 9 g,K 36 g,Met-Cu 1.5 g,Fe 10 g,Zn 8 g,Ca 230 g,Co 250 mg,Mn 1.9 g,I 32 mg,Se 50 mg。
3)營養(yǎng)水平為實測值。

1.2 試驗魚和飼養(yǎng)管理

試驗吉富羅非魚由廣東羅非魚良種場提供。在水泥暫養(yǎng)池馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。試驗開始時，選取健康、活潑、初始體重為(1.51±0.02)g的吉富羅非魚840尾，隨機分為6組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)35尾魚。飼養(yǎng)試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。系統(tǒng)由24個玻璃纖維桶和兩個過濾池等部分組成，纖維桶容積均為350 L(直徑90 cm，高80 cm，水體容積300 L)，養(yǎng)殖水源為經(jīng)過活性炭、珊瑚石過濾后的自來水，流水速率為1.5 L/min，養(yǎng)殖過程中不斷充氧曝氣，溶氧>7.0 mg/L，pH 7.5～8.0，氨氮≤0.10 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L，水溫25～31 ℃。每天分別在8∶30和18∶00投喂1次，飽食投喂。試驗時間為2015年8月29日—2015年10月23日，共56 d。

1.3 樣本采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，魚體饑餓24 h，每個重復(fù)取16尾魚，冰盤上解剖取其背肌，其中6尾用于測定抗氧化指標(biāo)，4尾用于測定滴水損失、肌肉膠原蛋白，6尾用于測定肌肉常規(guī)成分和氨基酸組成，樣品混合后于-80 ℃冰箱保存。

肌肉上清液制備：稱取一定質(zhì)量的肌肉樣品，加9倍體積的0.80%預(yù)冷生理鹽水，在冰水浴中進行勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存，用于測定肝臟抗氧化指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 抗氧化指標(biāo)

肌肉上清液用試劑盒進行抗氧化指標(biāo)測定，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體測定方法參照試劑盒所附說明書。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羥胺法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光法測定，總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測定，丙二醛(MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法測定。

1.4.2 營養(yǎng)指標(biāo)

肌肉常規(guī)成分測定：粗蛋白含量采用凱氏定氮法(GB/T6432-1994)、粗脂肪含量采用乙醚抽提法(GB/T6433-1994)、粗灰分含量采用550 ℃灼燒法(GB/T6438-1992)、水分含量采用冷凍干燥法(GB/T6435-1986)。

肌肉中膠原蛋白(羥脯氨酸)含量：羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中比例極少，其它蛋白中不存在。羥脯氨酸在氧化劑作用下產(chǎn)生的氧化物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其深淺可以推算出其含量。具體方法見南京建成生物工程研究所羥脯氨酸測定試劑盒說明書。

肌肉氨基酸：魚的背肌冷凍干燥(德國 CHRIST 公司)后粉碎。采用6 mol/LHCl水解法，用安捷倫液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity)衍生法測定。分析柱：安捷倫ZORBAX氨基酸分析柱，檢測波長：254 nm,柱溫：38 ℃，流速：1 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD,n=4)表示。采用 SPSS20統(tǒng)計軟件中 One-wayANOVA方差分析和 Duncan，s 均值多重比較法對試驗結(jié)果的差異顯著性進行分析處理，P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 6組吉富羅非魚肌肉的抗氧化指標(biāo)

各組吉富羅非魚肌肉SOD、GSH-Px、CAT活性、T-AOC及MDA含量見表2。100、300 mg/kg組肌肉SOD活性顯著高于其他組。肌肉GSH-Px、CAT活性各組間差異不顯著。500 mg/kg組肌肉T-AOC顯著高于對照組和1 000 mg/kg組，與其他組差異不顯著。肌肉MDA含量以50 mg/kg組最低，顯著低于對照組，但與其他組間差異不顯著。

表2 桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉中抗氧化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of mulberry leaf flavonoids on antioxidant indices in muscle of O.niloticus

注：表中同行數(shù)據(jù)后上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據(jù)后未標(biāo)注字母表示無顯著差異(P>0.05)。下同。

2.2 6組吉富羅非魚肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分

如表3所示，吉富羅非魚肌肉的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量組間差異不顯著，其中50～500 mg/kg組粗蛋白含量高于對照組。添加組粗脂肪含量均高于對照組，但沒有顯著差異。

表3 桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響Tab.3 Effects of mulberry leaf flavonoids on nutrients composition in muscle of O.niloticus %,wet matter

2.3 6組吉富羅非魚肌肉的膠原蛋白含量

如表4所示，500 mg/kg組的膠原蛋白最高，顯著高于其他組，其他添加組膠原蛋白含量均比對照組高，但差異不顯著。

表4 桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉膠原蛋白含量的影響(濕重)Tab.4 Effects of mulberry leaf flavonoids on collagen contents of O.niloticus(wet matter)

2.4 6組吉富羅非魚肌肉的氨基酸組成

由表5可知。50 mg/kg組肌肉所檢測的賴氨酸含量顯著高于對照組。100 mg/kg組肌肉丙氨酸含量顯著高于對照組。300 mg/kg組肌肉亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量顯著高于對照組。500 mg/kg組所檢測的15種肌肉氨基酸含量與對照組相比沒有顯著差異。1 000 mg/kg組肌肉組氨酸含量顯著高于對照組。添加組的必需氨基酸總量均高于對照組，但差異不顯著。100～1 000 mg/kg組風(fēng)味氨基酸含量高于對照組，但差異不顯著。

表5 桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉氨基酸組成的影響Tab.5 Effects of mulberry leaf flavonoids on muscle amino acids composition of O.niloticus %,dry matter

注：色氨酸未檢測。標(biāo)注*為風(fēng)味氨基酸.

3 討論

3.1 桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉抗氧化指標(biāo)的影響

活性氧(ROS)是細胞信號傳導(dǎo)、基因表達、細胞增殖調(diào)控的胞內(nèi)信使，而過多的活性氧會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化[10-11]。活性氧在屠宰后的肌肉繼續(xù)進行反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化物質(zhì)而影響肉質(zhì)。有研究表明，可通過在飼料中添加抗氧化劑以增強肌肉抗氧化能力，因屠宰后肌肉SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉，其系水力越高、肉色越好，即肉質(zhì)較好[12-13]。在魚飼料中添加適量抗氧化劑(VE)能抑制肌肉中脂肪的過氧化，降低肌肉MDA含量，改善肌肉品質(zhì)[14]。本試驗中，桑葉黃酮能顯著提高肌肉SOD活性、T-AOC，降低MDA含量。這與本實驗室前期研究中桑葉黃酮顯著提高羅非魚血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的結(jié)果類似[9]。這表明桑葉黃酮能夠提高羅非魚的抗氧化性能，改善肌肉品質(zhì)。宋瓊莉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉粉能顯著提高肌肉中SOD的活性，降低肌肉中MDA的含量，有效提高肌肉的抗氧化能力。根據(jù)以上研究結(jié)果推測，桑葉黃酮可能是存在桑葉中提高肌肉抗氧化能力的活性物質(zhì)之一。

3.2 桑葉黃酮對吉富羅非魚營養(yǎng)組成的影響

魚類的營養(yǎng)價值與肌肉粗蛋白含量密切相關(guān)，肌肉粗脂肪含量也會影響肌肉嫩度[16]。魚類肌肉的營養(yǎng)成分主要受基因的影響，也受生長環(huán)境、養(yǎng)殖方式、生長階段等因素影響。人工養(yǎng)殖條件下的水產(chǎn)動物肉品質(zhì)很大程度上由飼料的質(zhì)量決定，飼料的營養(yǎng)水平會影響?zhàn)B殖水產(chǎn)動物肌肉蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和一些風(fēng)味物質(zhì)的含量[17]。本試驗中，桑葉黃酮提高了吉富羅非魚肌肉粗蛋白含量，但影響不顯著，對粗脂肪含量也沒有顯著影響。有研究表明，一些黃酮類化合物可以促進動物生長激素生成和釋放[18],從而加快細胞的蛋白質(zhì)合成，減少蛋白質(zhì)的降解[19]。這表明桑葉黃酮中可能含有能促進動物生長激素生成和釋放黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮對崇仁麻雞母雛胸肌和腿肌的蛋白質(zhì)含量沒有影響，但降低了腿肌脂肪的沉積[20]，本實驗結(jié)果與這一報道有不一致的地方，究其原因可能是桑葉黃酮種類多樣、結(jié)構(gòu)豐富，禽類動物與水產(chǎn)動物生物學(xué)特性不同導(dǎo)致。

魚類肌肉中的膠原蛋白具有保持魚類肌肉完整性和韌性的作用，在一定程度上決定了肌肉的系水力和嫩度，在肌肉結(jié)構(gòu)和品質(zhì)等方面有重要作用[21]，羅非魚、草魚攝食蠶豆后肌肉膠原蛋白含量顯著提高，失水率降低，魚肉品質(zhì)得到改善[16]。本實驗中，500 mg/kg桑葉黃酮添加組的羅非魚肌肉膠原蛋白含量較對照組顯著增加。其作用機制可能是黃酮類化合物可以促進動物生長激素生成和釋放[18]，而生長激素能提高肌肉、皮膚等組織中膠原蛋白含量[22-23]。這有待進一步研究證明。

肌肉蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和質(zhì)量取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成和消化率等因素[24]。氨基酸組成和含量是肌肉品質(zhì)研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一，肉的鮮味在一定程度上與一些游離的風(fēng)味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的含量有關(guān)，其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的氨基酸，甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的氨基酸。游離氨基酸不僅本身能夠呈現(xiàn)出一定的味道，且在肌肉熱加工過程中，游離氨基酸會與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生大量的不同氣味的物質(zhì)，這些物質(zhì)決定了魚肉多樣性的風(fēng)味[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉營養(yǎng)成分與飼料組成密切相關(guān)，桑葉能夠提高肉羊肌肉呈味氨基酸含量的水平[27]。在肉羊日糧中添加沙蔥黃酮后，羊肉總氨基酸和必需氨基酸的含量上升，天冬氨酸和谷氨酸含量均髙于對照組，說明沙蔥黃酮可以提高肉的鮮味[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉黃酮提高了肌肉丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量。本實驗室先前研究結(jié)果顯示，適量的桑葉黃酮能提高羅非魚的增重[9]。由此可知，桑葉黃酮在促進羅非魚生長同時也能改善肌肉氨基酸組成。肌肉中風(fēng)味氨基酸和必需氨基酸的含量一定程度上能提高肌肉風(fēng)味和品質(zhì)。桑葉黃酮對羅非魚肌肉風(fēng)味氨基酸含量及必需氨基酸含量有一定提高作用，但不明顯。而其他植物來源的黃酮可以顯著提高動物肌肉必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸。黃酮類化合物在不同類型動物體內(nèi)作用的機制不同可能導(dǎo)致了這一現(xiàn)象的出現(xiàn)。

4 結(jié)論

添加適量的桑葉黃酮能夠提高吉富羅非魚肌肉抗氧化能力、膠原蛋白含量，改善肌肉營養(yǎng)組成。綜合肌肉抗氧化性能、膠原蛋白含量和氨基酸組成的指標(biāo)來評價，桑葉黃酮添加水平在300～500 mg/kg時效果較好。

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