腎氣虛哮喘大鼠Th17表達變化及益腎喘寧湯的干預作用研究*

余王琴 孔麗婭 羅玉玲 劉曉谷 鄭小偉

浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

現代醫學認為支氣管哮喘是由肥大細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞、T細胞等參與的炎癥性疾病，以氣道高反應性、氣道重塑為特征[1]。目前哮喘的發病機制尚不完全清楚，相關研究表明，Treg細胞與Th17細胞的免疫應答與哮喘的發病機制關系密切[2-4]。本實驗以卵清蛋白致敏法結合多因素復合法建立腎氣虛哮喘模型，通過大鼠脾臟流式細胞術，準確檢測出Th17細胞占整個細胞亞群的百分比及其變化情況，為探究哮喘的發病及藥物作用機制提供了理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物：清潔級Wistar雄性大鼠48只，體重200～250g，實驗動物中心常規飼養。

1.2 主要試劑：大鼠睪酮（T）ELISA試劑盒和大鼠甲狀腺素（T4）ELISA試劑盒（杭州誠維生物科技有限公司）；卵清白蛋白（Sigma有限公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640培養基（凱基生物有限公司）；氫氧化鋁分析純（上海凌峰化學試劑有限公司）。

1.3 實驗藥品：①益腎喘寧湯：主要由山藥、山萸肉、熟地黃、澤瀉、天漿殼、苦參、茯苓、牡丹皮、沉香片、五味子、黛蛤散、旋覆花、生黃芪等組成。將藥液濃縮至2.4kg/L。②普米克令舒（吸入用布地奈德懸浮液）：2ml，1mg×5支/袋，批號：317935。

2 方法

2.1 動物分組：將48只大鼠飼養7天后隨機分為正常組、哮喘組、腎氣虛哮喘組（腎哮組）、中藥組、西藥組、中西藥組（中西組）共6組，每組各8只。

2.2 造模方法：分述如下。

2.2.1 正常組：實驗的第1天和第8天予以生理鹽水1ml腹腔注射，第15天開始，每日給予30分鐘生理鹽水超聲霧化吸入，日1次，共14天。

2.2.2 哮喘造模：除正常組外，其他各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進行造模。實驗方法如下：①實驗第1天和第8天，用含卵清蛋白100mg，氫氧化鋁干粉100mg的生理鹽水混合液1ml注入腹腔內，使其致敏；②實驗第15天開始，將大鼠放于大小為65cm×45cm×45cm的透明罩內，以1%的卵清蛋白霧化吸入30分鐘，激發哮喘，日1次，連續激發至死亡。

2.2.3 腎氣虛造模：除正常組、哮喘組外，其他各組大鼠復合腎氣虛造模。具體方法：①實驗第1天，每日上午于同一時間對大鼠進行驚恐刺激，用梅花針叩擊大鼠背部（20次/分鐘），每次15分鐘；②每天下午讓大鼠負重游泳，先將冰袋放入深50cm的水槽中，待水溫降為16攝氏度時，分批次將尾部纏有重量為該大鼠體重10%保險絲的大鼠放入水槽中，使大鼠游泳至力竭（大鼠鼻尖沒入水中10秒）。日1次，共14天。

2.3 給藥處理：中藥組、西藥組、中西組大鼠于實驗第15天給藥。西藥組給予普米克令舒0.02%霧化吸入，中藥組給予2.0g/kg益腎喘寧湯灌胃，中西組給予中藥2.0g/kg灌胃、西藥普米克令舒0.02%霧化吸入。

2.4 樣本采集與處理：①血清采集：各組大鼠于干預后第15天處理，腹主動脈取血（10ml/只），靜置4小時后，1500rpm離心15分鐘，取上層血清，置-20℃冰箱備用；②脾臟采集：將脾臟取出，PBS沖洗組織后去除筋膜和結締組織，置-80℃冰箱備用。

2.5 指標檢測：分述如下。

2.5.1 腎氣虛證候相關檢測：血清睪酮（T）、血清甲狀腺素（T4）、血清皮質醇（COR）均使用酶聯免疫法檢測。

2.5.2 脾臟流式檢測：①大鼠脾臟單細胞懸液制備：用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養基沖洗研磨脾臟細胞，1000rpm/min離心10min；加3倍體積紅細胞裂解液室溫下孵育5～10min，1000rpm/min離心10min；棄上清液，加RPMI-1640培養液混勻，制成單細胞懸液。②流式細胞儀檢測大鼠脾臟Th17細胞的表達：激活：取2×106/ml脾臟單細胞懸液，在24孔板中每孔加入1ml細胞懸液，按比例加入PMA25μg/L，放入CO2培養箱中，孵育5h；胞外染色：取106/100μl細胞懸液至流式管中，加入Th17抗體，混勻，在4℃條件下避光孵育30min，1000rpm/min離心10min；破膜：在細胞懸液中加入已備好的預熱至37℃的BD CytofixTM Fixation Buffer 250ul，37℃下孵育15min，再加入-20℃的破膜劑Phosflow Perm Buffer 500ul，4℃避光孵育 20～30min；24h內上機檢測。

2.6 統計學方法：使用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析，以±s表示實驗結果，采用Q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠腎氣虛證候相關性指標檢測：腎氣虛哮喘組大鼠的T、T4、COR含量均低于正常組（P＜0.05），結合一般情況提示腎氣虛證哮喘造模成功。具體結果見表1。

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測定比較(±s，n=8）

表1 各組大鼠血清中T、T4、COR測定比較(±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與腎哮組比較，#P＜0.05。

正常組哮喘組腎哮組中西組西藥組中藥組141.29±3.45 141.45±4.62 52.31±6.2*127.36±7.53#107.23±6.31#112.42±3.25#95.47±6.32 84.00±6.0 48.32±1.4*84.22±4.07#56.38±3.08#68.04±4.19#78.41±1.48 75.61±1.92 65.29±2.73*73.00±3.57#68.08±2.67#70.36±1.97#

3.2 采用流式細胞術檢測大鼠脾臟Th17細胞水平變化情況：見表2。

表2 各組大鼠脾臟Th17表達情況比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠脾臟Th17表達情況比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，#P＜0.05；與腎哮組比較，△P＜0.05；☆交互效應檢驗P＜0.05

4 討論

益腎喘寧湯由七味都氣丸加味而得，用沉香、旋復花沉降之性，納氣平喘；取黃芪補氣而專固肌表[7]、升陽扶正之效；苦參、黛蛤散、天漿殼清肺化痰止咳。全方升中有降，補瀉兼施，諸藥合用，調和氣機，有補腎、納氣、平喘之功。Th17細胞是CD4+T淋巴細胞新亞群，其分泌的細胞因子IL-17有強大的促炎作用，能夠募集中性粒細胞，促進細胞釋放炎性因子,從而增加氣道的高反應性,促使氣道炎癥的發生[5]。同時，Th17還能誘導細胞活化，促進氣道組織纖維化從而使氣道重塑發生哮喘[6]。本研究結果顯示，哮喘組及腎哮組大鼠脾臟中的Th17細胞百分比高于正常組，由此我們可以推測，Th17細胞可促進氣道炎癥的發生，可能與哮喘發病相關。而中藥組、西藥組、中西組中大鼠Th17細胞比例較模型組降低，其中中西組Th17細胞數值下調最多。由此可見益腎喘寧湯與布地奈德均能有效降低機體內Th17細胞值，從而抑制炎癥細胞的增多，降低氣道炎癥反應，達到治療哮喘的效果，且中西藥結合干預的作用最明顯。

[1]Emma S Chambers,Alexandra M Nanzer,Paul E Pfeffer,et al.Distinct endotypes of steroid-resistant asthma characterized by IL-17A(high)and IFN-γ(high)immunoph-enotypes：Potential benefits of calcitriol［J］.JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2015，382(3)：628-637

[2]武維屏,崔紅生.試論支氣管哮喘從肝論治的生理病理學基礎［J］.中國中醫基礎醫學雜志,2002,8(10)：1-8.

[3]崔紅生,武維屏,靳德社.哮喘的臟腑論治［J］.中醫雜志,2004,45(7)：546-547.

[4]倪偉,于素霞,王宏長,等.緩解期哮喘患者腎陽虛與氣道炎癥關系的研究——附175例病例分析［J］.中國中醫基礎醫學雜志,2001,7(6)：60-61.

[5]王國營.參蛤青龍湯治療支氣管哮喘68例臨床觀察［J］.實用中醫內科雜志，2013，27(11)：17-19.

[6]黃念.加味定喘湯治療支氣管哮喘急性發作期(風寒束表痰熱內阻證)的臨床研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2012.

[7]陳永燦.簡易名方臨證備要[M].北京：人民衛生出版社，2016：513.