結核分枝桿菌RD區蛋白研究進展

，,2

研究表明，分枝桿菌起源于1.5億年以前[1]。結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)感染引起的一種慢性人獸共患傳染病，MTBC主要包括結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium.africanum) 、卡氏分枝桿菌(Mycobacterium.canetti) 、牛分枝桿菌(Mycobacterium.bovis)、田鼠型結核桿菌(Mycobacterium.microti)和卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin , BCG)[2]。早在1882年，德國細菌學家柯赫(Robert Koch)就已證明結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是結核病的病原菌[1]。Cole等[3]于1998年完成了對結核分枝桿菌 H37Rv全基因組測序，H37Rv基因組包含4 411 529個堿基對，約含4 000個基因，并且具有非常高的鳥嘌呤和胞嘧啶含量,與其他細菌的基因組相比，結核分枝桿菌基因組上存在很大一部分基因編碼參與脂肪生成和脂肪分解的酶、以及兩個富含甘氨酸的蛋白質家族，具有免疫學意義，可能是潛在的多態性抗原。隨著比較基因組學技術的發展，通過全基因組比對研究發現，結核分枝桿菌復合群中不同種細菌(如結核分枝桿菌、牛分枝桿菌或卡介苗)的基因組中存在一些缺失片段，這些缺失片段被稱為差異區域(Region of Differences，RD)，通稱為RD區。研究顯示，RD區基因與結核分枝桿菌的毒力密切相關，且這些基因的功能在結核病新型疫苗研發及新型診斷方法建立中具有重要的潛在意義及應用價值[4]。本文主要綜述結核分枝桿菌基因組RD區及其編碼蛋白的研究進展。

1 RD區概述

通過人造細菌染色體(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)數據庫和比較基因組學等方法，發現結核分枝桿菌復合群基因組中共有16 個RD區，即RD1-RD16，含有129個開放閱讀框,如表1所示。在不同的BCG 亞株和非結核分枝桿菌中缺失的片段又有所不同[5-6]。

表1 結核分枝桿菌差異區分布[7]

Tab.1 Distribution of regions of differences (RD) in M.tuberculosis

RDSizeofORF(kb)ORF(number)ORF(range)GeneSegment(s)ORF(bprange)19.59Rv3871-Rv3879c1607534-1698925.611Rv1978-Rv198888-8914211-859839.314Rv1573-Rv1586c707677-1692341.93Rv0221-Rv0223c1217432-1933552.85Rv3117-Rv312113527437-30212612.811Rv1506c-Rv1516c6523614-364377～9.08Rv2346c-Rv2353c10317622-2658483.44Rv0309-Rv03121617018-20446918.37Rv3617-Rv3623153-15421131-28321033Rv1255c-Rv1257c553689-66961128.85Rv3425-Rv3429145-14630303-14751224Rv2072c-Rv2075c939301-1133113～11.016Rv2645-Rv2660c11812475-2345514～9.18Rv1766-Rv1773c7930573-396421512.715Rv1963c-Rv1977881153-13873167.66Rv3400-Rv3405c1455012-12621

注：本文中的RD區命名依據實驗室目前正在進行的RD區基因多態性分析的參考文獻進行統一的校正，包括參考文獻的替換。

通過檢索 http://tuberculist.epfl.ch RD區基因功能如表2所示，所編碼的蛋白主要功能包括：相關蛋白生命活動過程所需的酶、潛在的診斷抗原和疫苗候選成分等。研究顯示RD區可能參與MTB的潛伏感染，并維持MTB的免疫自穩[8]。BCG是目前唯一批準使用的結核疫苗，但由于保護效力存在較大爭議，尤其是對成人結核病的預防保護效果不明顯，故新型結合疫苗的研發已經迫在眉睫。以往的研究已經證明，RD區的某些基因以重組BCG或DNA疫苗的形式在一定程度上可加強現行BCG的保護效率[9-10]。

表2 結核分枝桿菌差異區基因功能

Tab.2 M.tuberculosis RD region gene function

RD區基因編號基因名稱編碼蛋白RD區基因編號基因名稱編碼蛋白RD1Rv3871eccCb1ESX-1分泌系統相關蛋白eccCb1RD9Rv3617ephA環氧化物水解酶EphARv3872PE35PE家族相關蛋白PE35Rv3618Rv3618單加氧酶Rv3873PPE68PE家族相關蛋白PPE68Rv3619cesxVEsxV(ESAT-6)Rv3874esxBEsxB(CFP10)Rv3620cesxWEsxW(ESAT-6)Rv3875esxAEsxA(ESAT-6)Rv3621cPPE65PPE65Rv3876espIESX-1分泌相關蛋白EspIRv3622cPE32PE32Rv3877eccD1跨膜蛋白Rv3623lpqG脂蛋白LpqGRv3878espJESX-1分泌相關蛋白EspJRD10Rv1255cRv1255c轉錄調控蛋白Rv3879cespKESX-1分泌相關蛋白EspKRD2Rv1978Rv1978假定蛋白Rv1256ccyp130細胞色素P450Cyp130Rv1979cRv1979c透性酶Rv1257cRv1257c氧化還原酶Rv1980cmpt64抗原Mpt64RD11Rv3425PPE57PPE57Rv1981cnrdF1還原酶NrdF1Rv3426PPE58PPE58Rv1982cvapC36毒素VapC36Rv3427cRv3427c轉座酶Rv1983PE_PGRS35PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS35Rv3428cRv3428c轉座酶Rv1984ccfp21CFP21Rv3429PPE59PPE59Rv1985cRv1985cLysR家族轉錄調節蛋白RD12Rv2072ccobL甲基轉移酶cobLRv1986Rv1986轉運蛋白Rv2073cRv2073c脫氫酶Rv1987Rv1987幾丁質酶Rv2074Rv2074磷酸氧化酶Rv1988erm(37)23SrRNA甲基轉移酶Erm(37)Rv2075cRv2075c假定蛋白RD3Rv1573Rv1573噬菌體蛋白RD13Rv2645Rv2645假定蛋白Rv1574Rv1574噬菌體蛋白Rv2646Rv2646整合酶Rv1575Rv1575噬菌體蛋白Rv2647Rv2647假定蛋白Rv1576cRv1576c噬菌體蛋白Rv2648Rv2648轉座酶IS6110(片段)Rv1577cRv1577c噬菌體蛋白Rv2649Rv2649轉座酶IS6110Rv1578cRv1578c噬菌體蛋白Rv2650cRv2650c噬菌體蛋白Rv1579cRv1579c噬菌體蛋白Rv2651cRv2651c噬菌體蛋白酶Rv1580cRv1580c噬菌體蛋白Rv2652cRv2652c噬菌體蛋白Rv1581cRv1581c噬菌體蛋白Rv2653cRv2653c噬菌體蛋白Rv1582cRv1582c噬菌體蛋白Rv2654cRv2654c噬菌體蛋白Rv1583cRv1583c噬菌體蛋白Rv2655cRv2655c噬菌體蛋白Rv1584cRv1584c噬菌體蛋白Rv2656cRv2656c噬菌體蛋白Rv1585cRv1585c噬菌體蛋白Rv2657cRv2657c噬菌體蛋白Rv1586cRv1586c噬菌體整合酶Rv2658cRv2658c噬菌體蛋白RD4Rv0221Rv0221甘油三酯酶Rv2659cRv2659c噬菌體整合酶Rv0222echA1烯酰基水解酶EchA1Rv2660cRv2660c假定蛋白Rv0223cRv0223c乙醛脫氫酶RD14Rv1766Rv1766假定蛋白表2(續)RD區基因編號基因名稱編碼蛋白RD區基因編號基因名稱編碼蛋白RD5Rv3117cysA3硫代硫酸鹽硫轉移酶Cy-sA3Rv1767Rv1767假定蛋白Rv3118sseC1假定蛋白Rv1768PE_PGRS31PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS31Rv3119moaE1MoaE1Rv1769Rv1769假定蛋白Rv3120Rv3120假定蛋白Rv1770Rv1770假定蛋白Rv3121cyp141細胞色素P450Cyp141Rv1771Rv1771脫氫酶RD6Rv1506cRv1506c假定蛋白Rv1772Rv1772假定蛋白Rv1507cRv1507c假定蛋白Rv1773cRv1773c轉錄調節蛋白Rv1508cRv1508c膜蛋白RD15Rv1963cmce3R轉錄抑制因子Mce3RRv1509Rv1509假定蛋白Rv1964yrbE3A膜蛋白yrbE3ARv1510Rv1510膜蛋白Rv1965yrbE3B膜蛋白yrbE3BRv1511gmdAGDP-D-甘露糖脫水酶Gm-dARv1966mce3AMce3ARv1512epiA核苷酸異構酶EpiARv1967mce3BMce3BRv1513Rv1513假定蛋白Rv1968mce3CMce3CRv1514cRv1514c假定蛋白Rv1969mce3DMce3DRv1515cRv1515c假定蛋白Rv1970lprMmce3E家族脂蛋白(lprM)Rv1516cRv1516c糖基轉移酶Rv1971mce3FMce3FRD7Rv2346cesxOEsxO(ESAT-6)Rv1972Rv1972MCE相關膜蛋白Rv2347cesxPEsxP(ESAT-6)Rv1973Rv1973MCE相關膜蛋白Rv2348cRv2348c假定蛋白Rv1974Rv1974膜蛋白Rv2349cplcC磷酸酯酶plcCRv1975Rv1975假定蛋白Rv2350cplcB膜磷酸酯酶plcBRv1976cRv1976c假定蛋白Rv2351cplcA膜磷酸酯酶plcARv1977Rv1977假定蛋白Rv2352cPPE38PPE38RD16Rv3400Rv3400水解酶Rv2353cPPE39PPE39Rv3401Rv3401假定蛋白RD8Rv0309Rv0309假定蛋白Rv3402cRv3402c假定蛋白Rv0310cRv0310c假定蛋白Rv3403cRv3403c假定蛋白Rv0311Rv0311假定蛋白Rv3404cRv3404c假定蛋白Rv0312Rv0312假定蛋白Rv3405cRv3405c轉錄調節蛋白

2 RD區研究進展

2.1RD1區 RD1區全長9.5 kb，包含9個閱讀框，即Rv3871～Rv3879c，在結核分枝桿菌H37Rv和牛分枝桿菌基因組中存在，在全部BCG菌株中缺失。RD1區所編碼的蛋白是結核分枝桿菌的主要毒力因子之一，被認為在結核分枝桿菌的致病過程中起著關鍵的作用[11]。Rv3871編碼的eccCb1蛋白是ESX-1分泌系統的重要組成部分，可與Rv3870編碼的蛋白結合共同形成分子轉運通道；又能與ESAT-6/CFP-10二聚體結合參與其分泌轉位；也有研究揭示，Rv3871編碼的蛋白可能在ESAT-6/CFP-10蛋白的折疊、分泌過程中起到關鍵性作用。卡介苗基因組中的這段序列的缺失可能與其保護力減弱有直接關系[12]。Rv3872編碼的PE35蛋白和Rv3873編碼的PPE68蛋白可能在結核病的發病過程中起重要作用、有助于結核分枝桿菌感染狀態的建立和維持，此外PE35和PPE68蛋白在結核病的感染發病過程中起著重要的免疫調節作用[13]。Rv3874和Rv3875分別編碼CFP-10和ESAT-6兩個低分子質量的蛋白[14]。這兩個基因的表達受同一個啟動子調控，其產物CFP-10和ESAT-6形成的緊密的1∶1的蛋白質復合物發揮生物學功能；CFP-10的C-末端形成的氨基酸臂，對蛋白質的分泌起重要作用；分泌型結核分枝桿菌復合蛋白CFP-10和ESAT-6可能在病原體-宿主細胞信號傳導中發揮關鍵作用，在結核病發病機制中起重要作用[11]。Ming Zhang[15]等使用遺傳學方法證實Rv3876編碼的EspI蛋白是結核分枝桿菌ESX-1分泌系統的組成部分之一，在細胞ATP水平消耗的條件下，EspI在負向調節ESX-1介導的分泌過程中起著重要作用。Rv3877編碼的跨膜蛋白eccD1是組成蛋白質分泌通道的主要成分[16]。Rv3878編碼ESX-1分泌相關蛋白EspJ，且EspJ與蘇氨酸蛋白激酶(Serine Threonine Protein Kinase，STPK)介導的磷酸化聯合作用是促進分枝桿菌生長的主要機制之一[17]。Rv3879編碼的分泌蛋白EspK能夠和Rv3871編碼的蛋白eccCb1相互作用，促進蛋白Rv3881c/Mh3881c(EspB)的分泌[18]。

2.2RD2區 RD2區全長5.6 kb，包含11個閱讀框，即Rv1978～Rv1988c，在牛分枝桿菌基因組和部分BCG菌株中存在，在BCG-Danish、BCG-Prague、BCG-Glaxo、BCG-Connaught、BCG-Phipps、BCG-Tice和BCG-Pasteur菌株中缺失。RD2區在結核分枝桿菌毒力方面起到重要作用，某些基因編碼的蛋白與BCG的安全性和宿主的免疫應答有關，如Rv1979c可能是一種氨基酸轉運蛋白，并且該基因的缺失可能抑制巨噬細胞的生長。Rv1980c編碼的MPT64和Rv1984c編碼的CFP21，可誘導機體產生強烈的免疫應答[19]。RD2區在結核分枝桿菌中的缺失導致巨噬細胞和小鼠中的細菌生長減少，并且巨噬細胞的感染，導致TNF-α水平增加和細胞凋亡，提示RD2區中編碼的MPT64蛋白在宿主細胞內具有抗細胞凋亡作用[20]。Rv1982c可以編碼毒素-抗毒素家族蛋白(Toxin-Antitoxin，TA)VapC36，VapC36可以通過RNA酶活性抑制翻譯[21]。有研究選取Rv1981c編碼的NrdF1、Rv1983編碼的PE__PGRS35，Rv1985c和Rv1986等4種蛋白進行原核融合表達與純化，分別以 NrdF1、PE＿PGRS35、Rv1985c和Rv1986等4種融合蛋白純化產物作為抗原，用間接酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)對血清中的特異抗體進行檢測 ，結果顯示4種蛋白的陽性檢出率分別為7.35%、22.06%、16.18%和16.18%，具有用作牛結核病血清學診斷試劑的潛能[22]。Rv1987蛋白是RD2區基因編碼的一種具有免疫效力的分泌蛋白，有研究表明， Rv1987蛋白可以調節宿主免疫反應向Th2型細胞應答轉化，這可能有助于細菌逃逸宿主免疫識別[23]。Rv1988編碼的蛋白作為重要的分枝桿菌毒力因子，可以作為治療分枝桿菌感染的潛在靶標[24]。Rv1978編碼的蛋白為假定蛋白。(如表2所示)。

2.3RD3區 RD3區全長9.3 kb，包含14個閱讀框，即Rv1573～Rv1586c，在牛分枝桿菌基因組中存在，在全部BCG菌株中缺失。研究表明，噬菌體衣殼蛋白Rv1576c、Rv1578c和噬菌體整合酶Rv1586c可能與結核分枝桿菌適應環境及發病機制有關[25]。Rv1580c可能是鑒定血清樣品中牛分枝桿菌感染的理想選擇[26]。Rv1573-Rv1585c編碼的蛋白為噬菌體蛋白。(如表2所示)。

2.4RD4區 RD4區,全長1.9 kb，包含3個閱讀框，即Rv0221、Rv0222和Rv0223c，在結核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在BCG和牛分枝桿菌基因組中缺失。Rosenkrands[27]等對結核分枝桿菌差異區RD2-7、RD9-13 和RD15的47個基因進行基因克隆表達，并純化重組蛋白，采用血清學檢測，發現Rv0222編碼的蛋白EchA1具有很高的血清學診斷價值，并且在人類免疫缺陷(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染患者中呈現較高的靈敏度，其識別HIV陽性結核患者的靈敏度為43%，識別HIV陰性肺結核患者的靈敏度為30%。張慧漲[28]等在Rv0222/ESAT-6融合蛋白的結核病血清學診斷價值的研究中發現，以Rv0222/ESAT-6融合蛋白為抗原的ELISA方法診斷結核病的敏感性為86%，特異性為100%，證明了Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISA方法對結核病(包括合并HIV感染者)的血清學診斷具有較高的應用價值。王慶等在結核分枝桿菌重組蛋白Rv0222的表達及血清學鑒定實驗中也證明了Rv0222的診斷潛能[29]。Rv0221和Rv0223c編碼的蛋白分別為甘油三脂酶和乙醛脫氫酶(如表2所示)。

2.5RD5區 RD5區全長2.8 kb，包含5個閱讀框，即Rv3117、Rv3118、Rv3119、Rv3120和Rv3121，在結核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在BCG和牛分枝桿菌基因組中缺失。RD5區的完整性可能與生物毒力作用增加有關[30]。通過對60名HIV感染合并結核病患者、32名健康對照者的血清，用酶聯免疫法進行檢測發現，Rv3117和Rv3120之間顯示其敏感性差異具有統計學意義；和采用ESAT-6作為抗原(敏感性21.7%，特異性90.6%)相比，Rv3117(敏感性25%，特異性96.9%)和Rv3120(敏感性31.7%，特異性96.9%)的敏感性和特異性均有所提高；這表明Rv3117和Rv3120在結核病血清學診斷方面具有較高的敏感性，可用于診斷結核分枝桿菌感染[31]。Rv3121編碼細胞色素蛋白Cyp141，可能參與調節宿主的免疫反應，可以作為新型疫苗的候選成分、在結核病的診斷方面具有潛在的價值[32]。Rv3118編碼的蛋白為假定蛋白，Rv3119編碼的蛋白為MoaE1(如表2所示)。

2.6RD6區 RD6區全長12.8 kb，包含11個閱讀框，即Rvl506c-Rvl516c，其中包含編碼3個糖代謝途徑中的相關蛋白，如GDP-D-甘露糖脫水酶GmdA (Rv1511)、核苷酸異構酶EpiA(Rv1512)和糖基轉移酶Rv1516c(Rv1516c)；以及2個膜蛋白，如Rv1508c和Rv1510。在結核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。通過對重組蛋白Rv1515c在分枝桿菌和宿主相互作用中的功能研究發現，Rv1515c能夠通過影響脂肪酸的合成而引起一系列菌落表型變化，包括滑動能力、單菌落形態和生物膜的形成，從而增強恥垢分枝桿菌在體外的存活能力，并能使鼠源巨噬細胞RAW264.7和人源巨噬細胞THP-1中細胞因子IL-6和IL-10 mRNA表達水平顯著下調，這表明Rv1515c蛋白是與結核分枝桿菌致病性相關的一種調控蛋白，可作為一種新型的抗結核藥物靶點[33]。也有研究發現，Rv1516c蛋白在結核分枝桿菌的全細胞裂解物中表達，鑒定的血清反應性肽可能在結核病的特異性血清診斷中有重要作用[34]。Rv1506c、Rv1507c、Rv1509、Rv1513和Rv1514c編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.7RD7區 RD7區全長9.0 kb，包含8個閱讀框，即Rv2346c-Rv2353c，在結核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。曹嚴明[35]等對Rv2352c蛋白進行基因克隆表達、純化后，免疫新西蘭兔，發現能夠刺激產生高滴度的抗體反應；之后對Rv2352c重組蛋白進行免疫印跡分析，結果顯示該重組蛋白能與結核病人的血清發生良好免疫反應；證明Rv2352c蛋白具有很好的免疫原性和抗原性。張紅梅[36]檢測了3個PPE重組蛋白Rv3425、Rv3429和Rv2353c和兩個對照抗原CFP-10和ESAT-6，在識別結核病人和健康對照者血清中IgG抗體的反應，發現以Rv2353c為抗原，檢測出肺結核病人血清中特異IgG敏感性可達16.0%，而檢測肺外結核病人血清中特異IgG敏感性為12.5%；與接種過BCG疫苗的健康對照者相比較，Rv2353c抗原在檢測結核病人中的特異性為96.4%，雖然特異性比較高，可是在檢測結核病人的敏感性方面較低，用于診斷的實際價值不大。Rv2346c基因編碼的蛋白能夠誘導結核桿菌在巨噬細胞內的氧化應激來提高結核菌的生存能力[37]。Rv2347c基因編碼的蛋白可能與結核分枝桿菌毒力有關[38]。Rv2348c編碼的蛋白為假定蛋白，Rv2349c、2350c和Rv2351c編碼的蛋白分別為磷酸酯酶C(PlcC)、膜磷酸酯酶B(PlcB)和膜磷酸酯酶A(PlcA)(如表2所示)。

2.8RD8區 RD8區全長3.4 kb，包含4個閱讀框，即Rv0309-Rv0312，在非洲分枝桿菌和BCG基因組中存在，在牛分枝桿菌基因組中缺失。蔣天舒等[39]構建了高效表達的Rv0309重組質粒，獲得高純度的Rv0309重組蛋白，研究表明Rv0309具有誘導宿主產生保護性免疫應答作用，為進一步利用該抗原制備結核新疫苗進行結核病的防治研究提供了一定的基礎。Rv0310c、Rv0311和Rv0312編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.9RD9區 RD9區全長18.3 kb，包含7個閱讀框，即Rv3617-Rv3623，在結核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。有研究用重組Rv3618蛋白作為抗原，采用ELISA檢測7l例肺結核患者血清中特異性Rv3618蛋白和38 kD蛋白的IgG抗體，發現Rv3618與38 kD蛋白聯合可用于肺結核病患者的血清學檢測，且呈現較高的敏感性， Rv3618蛋白可作為結核病血清學診斷的抗原之一[40]。也有研究揭示IS6110和Rv3618基因可以作為檢測結核分枝桿菌的分子靶標；使用PCR-ICT(免疫色譜測試)測定法，同時檢測1 500個臨床痰標本中的MTBC和MTB。將結果與傳統培養和生化鑒定結果進行比較，并與患者的臨床結果進行比較，整體敏感性為93.0%，特異性為99.8%，其中檢測MTBC的靈敏度為95.5%、特異性為97.9%，檢測MTB的靈敏度為93.0%、特異性為99.8%，證明Rv3618在結核病的診斷上具有較好的潛在應用價值[41]。Rv3620c也是結核分枝桿菌的重要免疫顯性抗原。以Ag85B-ESAT6-Rv3620c融合基因重組卡介苗構建了一種新型重組卡介苗(recombinant BCG，rBCG)，動物實驗結果顯示與BCG相比，這種rBCG可以顯著增加Th1型細胞免疫應答和特異性體液應答，這將對新型卡介苗的研發有重要指導性意義[42]。曹廷明[43]等成功構建原核表達重組質粒pET30a(+)-Rv3623，證實Rv3623蛋白具有較好的免疫原性并制備了其多克隆抗體，為進一步研究其作為診斷結核病的潛在分子標志物的可行性奠定了基礎。Rv3617編碼的蛋白為環氧化物水解酶EphA，Rv3619c編碼的蛋白為EsxV(ESAT-6)，Rv3621c的預測功能為PPE65，Rv3622c編碼蛋白PE32(如表2所示)。

2.10RD10區 RD10區全長3.0 kb，包含3個閱讀框，即Rv1255c-Rv1257c，在結核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。RD10區促進對結核分枝桿菌的保護作用，而與毒力作用無關，因此，可用于新疫苗研發[44]。Rv1255c的編碼蛋白為轉錄調控因子，Rv1256c編碼的蛋白為細胞色素 P450 Cyp130，Rv1257編碼的蛋白為氧化還原酶(如表2所示)。

2.11RD11區 RD11區全長28.8 kb，包含5個閱讀框，即Rv3425-Rv3429，在結核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在BCG基因組中缺失。吳興福[45]等用H37Rv免疫的兔血清進行間接酶聯免疫吸附試驗測定融合蛋白CFPl0-ESAT6-Rv3425的免疫原性，結果顯示該蛋白具有較強的免疫原性，可作為結核病免疫診斷的一個候選抗原。研究表明Rv3425蛋白在結核病診斷方面具有很高的應用價值[46]。Rv3426的預測功能為編碼蛋白PPE58，Rv3427c和Rv3428c編碼的蛋白為轉座酶，Rv3429編碼蛋白PPE59(如表2所示)。

2.12RD12區 全長2.0 kb，包含4個閱讀框，即Rv2072c、Rv2073c、Rv2074和Rv2075c，在結核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在BCG基因組中缺失。葉娟[47]成功誘導表達純化了RD12區抗原Rv2074，血清學檢測結果顯示蛋白Rv2074具有較高的敏感性和特異性，但未進行細胞免疫學活性的驗證。Tan[48]在研究Rv2073c和Rv2074兩種蛋白時發現，與健康對照組相比，蛋白Rv2073c只在結核組誘導分泌高水平的IFN-γ，且呈正相關關系，這表明Rv2073c可能是結核分枝桿菌特異性診斷試劑和疫苗的備選成分之一。Rv2072c和Rv2075c編碼的蛋白分別為甲基轉移酶cobL和假定蛋白(如表2所示)。

2.13RD13區 RD13區全長11.0 kb，包含16個閱讀框，即Rv2645-Rv2660c，在結核分枝桿菌H37Rv和牛分枝桿菌基因組中存在，在BCG基因組中缺失。研究發現，結核病人外周血中Rv2645特異性刺激產生IFN-γ水平比健康人更高；Rv2645能夠誘導接種熱滅活的結核桿菌H37Rv的小鼠發生結核分枝桿菌特異性皮膚試驗反應，有可能作為一種新型細胞介導的結核免疫診斷劑[49]。有研究對 ESAT-6、CFP10、Rv2031c、Rv2654c和Rv1038c免疫原機制進行對比時發現，CFP10占最主導地位，Rv2654c幾乎不表達[50]。楊丹等發現，Rv2657c蛋白既有B細胞表位也有T細胞表位，可能成為結核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原[51]。有研究表明，純化的重組Rv2659c蛋白，在潛伏性結核感染患者中可引起T細胞應答的選擇性免疫原性；因此，它具有潛在的診斷價值，可能是對潛伏性結核感染使用的疫苗候選之一[52]。Rv2646編碼的蛋白為整合酶，Rv2648編碼的蛋白為轉座酶IS6110(片段)，Rv2649編碼的蛋白為轉座酶IS6110，Rv2650c、Rv2652c、Rv2653c、Rv2655c、Rv2656c和Rv2658c編碼的蛋白為噬菌體蛋白，Rv2651c編碼的蛋白為噬菌體蛋白酶，Rv2647和Rv2660c編碼的蛋白都為假定蛋白(如表2所示)。

2.14RD14區 RD14區全長9.1 kb，包含8個閱讀框，即Rv1766-Rv1773c，在大部分BCG基因組中存在 ，在牛分枝桿菌基因組和BCG-Pasteur菌株中缺失。研究表明Rv1769和Rv1772都可作為T細胞抗原，誘發較強的T細胞免疫反應，可以作為潛在的細胞免疫檢測抗原或亞單位疫苗成分[53]。Rv1771編碼一種脫氫酶，具有合成維生素C的能力[54]。Rv1766、Rv1767和Rv1770編碼的蛋白為假定蛋白，Rv1768編碼的蛋白為PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS31，Rv1773c編碼的蛋白為轉錄調控蛋白(如表2所示)。

2.15RD15區 RD15區全長12.7 kb，包含15個閱讀框，即Rv1963c-Rv1977，在結核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。Rv1966-Rv1971分別編碼蛋白質Mce3A、Mce3B、Mce3C、Mce3D、Mce3E和Mce3F，研究表明Mce3A-F蛋白在結核分枝桿菌體外生長過程中及其mRNA中表達，可能與結核分枝桿菌的發病機制有關[55]。Rv1973編碼的蛋白是結核分枝桿菌的外膜蛋白[56]。Jiang Y等發現Rv1977編碼的蛋白可能是一種特異性抗原，它可能參與宿主免疫逃避[57]。Rv1963c編碼的蛋白為轉錄抑制因子Mce3R，Rv1964、Rv1965、Rv1972和Rv1974編碼的蛋白為膜蛋白，Rv1975和Rv1976c編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.16RD16區 RDl6區全長7.6 kb，包含6個閱讀框，即Rv3400、Rv3401、Rv3402c、Rv3403c、Rv3404c和Rv3405c，在大部分BCG基因組中存在，在牛分枝桿菌基因組、BCG-Moreau菌株和BCG-Russia菌株的基因組中缺失。Rv3400編碼一種水解酶，參與分枝菌酸合成[58]。朱琳等發現抗原Rv3400能夠誘導高水平IL-6和TNF-a的分泌，增加巨噬細胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達，提高巨噬細胞吞噬能力；亞單位疫苗Rv3400-IFA在C57BL/6小鼠體內可產生較好的細胞免疫和體液免疫效應，Rv3400有望成為新型結核病疫苗及診斷標志物的候選成分[59]。研究表明，NF-κB、ERKl/2和p38信號通路的激活是Rv3402c蛋白誘導產生TNF-α所必需的，而且NF-κB、ERKl/2信號通路是Rv3402c誘導的IL分泌所需的，Rv3402c也可以通過干擾宿主的信號途徑來擾亂宿主的免疫應答，最終導致巨噬細胞的快速裂解以及細菌在胞內的存活率提高[60-61]。Rv3401、Rv3403c和Rv3404c編碼的蛋白為假定蛋白，Rv3405c編碼的蛋白為轉錄調控蛋白(如表2所示)。

3 展 望

結核分枝桿菌基因組變異具有多樣性，而宿主對結核分枝桿菌的免疫，首先是細胞免疫，其次是體液免疫，用單一抗原或單一方法只能檢出一部分的感染者，效果不令人滿意，而且，由于BCG的接種和非結核分枝桿菌感染的交叉免疫反應，導致免疫學檢測診斷的特異性不理想，使得結核病免疫學診斷的臨床應用價值大大減低。目前，BCG的預防效果差，特別是對成人結核病。因此，高度特異和靈敏的免疫學診斷技術和更有效的結核病新疫苗的研發成為亟待解決的科學難題，這主要依賴于特異抗原及其相關技術的突破。結核分枝桿菌16個RD區對于研究結核分枝桿菌的進化歷程、毒力機制以及免疫學診斷具有重要的研究價值。結核分枝桿菌基因組RD區抗原，由于絕大多數在BCG和非結核分枝桿菌基因組中缺失，以其為基礎的血清學診斷和疫苗研制具有獨特的優越性；然而，可能是不同的個體對不同抗原的免疫應答不同，同一個體不同的感染(疾病)階段對同一抗原的免疫應答不同、以及種族不同、結核病的發病環境和抗原來源不同、臨界值算法不同等等[62]，結核病免疫診斷的敏感性和特異性有很大的可變性，尤其是單一抗原效果極不理想。因此，RD區蛋白抗原聯合應用能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性，對結核病的診斷和預防具有十分重要的應用價值。

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