澤瀉HPLC-UV指紋圖譜研究

張麗娜，張 兵，薛志峰，韓鵬軍，皮佳鑫，李 楠，祁東利*，劉志東*

(1.天津中醫藥大學，現代中藥發現與制劑技術教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193)

中藥澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam) Juzep.的干燥塊莖，性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效，常用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛和高血脂癥[1]。澤瀉的化學成分主要有三萜類化合物、倍半萜類化合物、二萜類化合物、多糖和其他成分[2-5]，其中三萜類化學成分均為原萜烷型四環三萜，主要包括澤瀉醇A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O及其同系物等，具有降血脂[6-9]、抗動脈粥樣硬化[10-12]和保肝[13]等藥理活性；澤瀉中倍半萜類化學成分主要是愈創木烷型(環氧澤瀉烯)、吉瑪烷型(半萜吉瑪烯C、吉瑪烯D)、桉葉型(桉烯二醇)和O-plopanane型等[14-16]，其中以環氧澤瀉烯為主的愈創木烷型化合物抑制核因子κB (NF-κB) 活性，抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達，抑制一氧化氮的產生，具有抗炎活性[17-20]，該類成分可能是澤瀉治療熱淋澀痛的主要物質。澤瀉質量分析多用HPLC指紋圖譜技術來研究不同批次澤瀉的質量差異，大多數報道主要指認原萜烷型三萜化合物。本文建立了澤瀉的HPLC-UV指紋圖譜法，對11批澤瀉進行指紋圖譜研究，成分指認兼顧原萜烷型三萜成分和倍半萜類成分，以期為全面評價澤瀉的質量提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XP205型十萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Mill-QⅡ型超純水機(美國Millipore公司)；FW100型萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2試藥 環氧澤瀉烯對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數≥98%)；23-乙酰澤瀉醇B對照品(購自天津中新藥業有限公司，質量分數≥98%)；甲醇、乙腈均為色譜純(購自Fisher Scientific公司)；澤瀉由正大青春寶藥業有限公司提供，按照《中國藥典》2015年版一部方法檢驗，鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam) Juzep.塊莖的干燥飲片，產地和批號見表1。

表1澤瀉的編號、產地及批次信息

Tab.1 Producing places and batches ofRhizomaalismatis

編號產地批號編號產地批號S1四川14010S7江西14001S2四川14011S8江西14002S3四川14012S9江西14003S4福建14007S10浙江14004S5福建14008S11浙江14005S6福建14009

2 方法與結果

2.1供試品溶液的制備 取各批次澤瀉適量，粉碎，過60目篩，精密稱取2 g粉末，置于25 mL量瓶中，加乙腈超聲(400 W，40 kHz)30 min，放冷至室溫，定容，搖勻，過0.45 μm有機濾膜，續濾液作為供試品溶液。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取環氧澤瀉烯對照品和23-乙酰澤瀉醇B對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成環氧澤瀉烯和23-乙酰澤瀉醇B質量濃度均為0.2 mg·mL-1的對照品溶液，過0.45 μm有機濾膜，續濾液作為對照品溶液。

2.3色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(B)-水(A)，梯度洗脫(0～5 min，35%B；5～10 min，35%B～55%B；10～15 min，55%B～70%B；15～20 min，70%B～75%B；20～40 min，75%B)。流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性考察 取2.1項下制備的供試品溶液(批號14010)、2.2項下制備的23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液和環氧澤瀉烯對照品溶液以及空白乙腈各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項下色譜條件，連續進樣3次，記錄色譜圖，見圖1。

2.4.2精密度考察 取2.1項下制備的供試品溶液(批號14010)，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項下色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖，結果表明，10個共有峰相對保留時間的RSD值在0.01%～0.25%，相對峰面積的RSD值在0.89%～5.55%，結果表明，儀器精密度良好。

圖1HPLC圖

a.空白乙腈；b.23-乙酰澤瀉醇B對照品；c.環氧澤瀉烯對照品；d.樣品。

Fig.1 HPLC chromatograms

a.blank acetonitrile；b.23-acetate alisol B reference substance；c.alismoxide reference substance；d.sample.

2.4.3重復性考察 取同一批樣品(批號14010)，按照2.1項下方法制備供試品溶液6份，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果表明，10個共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.25%，相對峰面積的RSD值在1.34%～4.62%，結果表明，該方法重復性良好。

2.4.4穩定性考察 取同一供試品溶液(批號14010)，分別在0，4，8，12，24和48 h進樣6次，按照2.3項下色譜條件進樣，注入高效液相色譜儀，進行測定，結果表明，10個共有峰相對保留時間的RSD值在0.01%～0.34%，相對峰面積的RSD值在0.43%～7.76 %，結果表明，供試品溶液在48 h內穩定性較好。

2.5指紋圖譜的建立及相似度評價

2.5.1指紋圖譜的建立 取11批澤瀉，按照2.1項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項下色譜條件進樣分析，所得澤瀉指紋圖譜共有10個共有峰，其中峰1和10分別是環氧澤瀉烯和23-乙酰澤瀉醇B，色譜圖見圖2。計算11個批次10個峰的相對保留時間RSD值在0.011 2%～0.231 7%，相對峰面積RSD值在8.5%～86.7%。

2.5.2相似度評價 用國家藥典委員會提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012.130723版)對11批澤瀉樣品高效液相的分析結果進行相似度評價，3號峰峰面積最大且穩定，故選擇3號峰作為參比峰(S)，四川澤瀉14010(S1)作為參照，利用中位數法，時間窗設為1 min，進行多點校正，Mark峰匹配，生成對照指紋圖譜R，以對照指紋圖譜R作為參照圖譜，11批澤瀉指紋圖譜與之進行相似度比較和評價，S1～S11澤瀉樣品相似度結果分別是0.997，0.972，0.991，0.941，0.994，0.860，0.995，0.967，0.950，0.952和0.969，各批次澤瀉相似度較高。指紋圖譜見圖3。

圖2澤瀉指紋圖譜

1.環氧澤瀉烯；2.23-乙酰澤瀉醇B。

Fig.2 Fingerprint chromatogram ofRhizomaalismatis

1.alismoxide；2.23-acetate alisol B.

圖3澤瀉的指紋圖譜疊加圖和對照指紋圖譜R

Fig.3 Fingerprint ofRhizomaalismatisand reference fingerprintR

3 討論

3.1檢測波長 優化本研究在澤瀉飲片指紋圖譜中指認原萜烷類化合物23-乙酰澤瀉醇B和倍半萜類化合物環氧澤瀉烯，從兩類具有活性化合物的分析角度出發，進行澤瀉指紋圖譜研究，可相對全面地評價澤瀉的質量差異。3D全波長(208～400 nm)掃描結果見圖4，這兩類化合物均為末端吸收，故選擇210 nm作為檢測波長。

3.2環氧澤瀉烯的指認 本研究采用HPLC-UV法進行澤瀉的指紋圖譜研究，首次使用愈創木烷型化合物環氧澤瀉烯對照品對澤瀉指紋圖譜色譜峰進行指認，實驗方法學考察結果表明，此方法重復性好、精密度和穩定性高，適用于澤瀉飲片的質量評價研究。研究結果顯示，11批澤瀉藥材中環氧澤瀉烯峰面積波動較小，無明顯差異，說明環氧澤瀉烯對不同產地澤瀉指紋相似度影響較小。

圖43D掃描圖譜

Fig.4 3D HPLC chromatograms of scanning atlas

3.323-乙酰澤瀉醇B的指認 文獻報道，23-乙酰澤瀉醇B在新鮮植物中含量很高，是植物體內存在的主要形式，而23-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇G和23-乙酰澤瀉醇E等化合物在鮮品中沒有或含量很低[21]。從生物途徑角度來看，這些化合物均是23-乙酰澤瀉醇B的次級代謝產物[3，5]。不同產地[22-23]、采收期[24-25]和炮制加工方法[22，26-27]對植物體內代謝酶的水平和活性有影響，從而影響23-乙酰澤瀉醇B向澤瀉醇A、澤瀉醇A單乙酸酯和澤瀉醇C等化合物的代謝轉化過程[6]，造成原萜烷型四環三萜類化合物的含量和指紋差異。實驗觀察到了這種指紋差異，S6(福建)藥材的相似度為0.860，低于其他產地藥材的相似度。由圖3可知，S6藥材中8和10號峰明顯大于其他藥材對應峰，而10號峰被指認為23-乙酰澤瀉醇B，說明不同產地藥材中23-乙酰澤瀉醇B的生物合成水平與代謝轉化過程存在差異。

23-乙酰澤瀉醇B及其次級代謝產物在降血脂活性方面有顯著差異，其中24-乙酰澤瀉醇A降膽固醇作用最強，23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B次之，澤瀉醇B未見抑制血脂升高作用[28]。結果表明，23-乙酰澤瀉醇B的代謝轉換過程研究對澤瀉質量控制具有重要意義。本文根據澤瀉藥材的藥理作用和相關活性成分，建立了基于愈創木烷型倍半萜成分和原萜烷型四環三萜類化合物為指認成分的指紋圖譜研究，發現了部分產地澤瀉的相似度較低，指出了23-乙酰澤瀉醇B的代謝轉化差異是造成藥材指紋圖譜相似度低的原因之一，為全面評價澤瀉藥材的質量奠定了理論基礎。23-乙酰澤瀉醇B代謝轉換過程的差異引起澤瀉藥材的藥理作用變化和質量優劣有待進一步研究。

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