黑番茄濃縮漿HPLC指紋圖譜研究及7個成分的定量分析

2018-05-18 08:00:03肖會敏雷美娜柴在軍王四旺

西北藥學雜志 2018年3期

肖會敏，雷美娜，何悅，柴在軍，王四旺*

(1.空軍軍醫大學藥學院藥物研究所，西安 710032；2.甘肅大漠紫光生物科技有限公司，蘭州 730030)

黑番茄(Black tomato)屬于被子植物門雙子葉植物綱茄目茄科番茄屬，原產南美洲，后經德國、美國專家研究培育成優質種籽[1]。黑番茄有“沙漠黑金剛”之稱，是番茄家族的珍品，因其果色和果實均為紅黑色而得名[2-3]。黑番茄含有大量的茄紅素，豐富的維生素C和抗氧化物質，易被人體吸收，具有預防前列腺癌、心臟病、乳腺癌、子宮頸癌和結腸癌等功效，預防乳腺癌效果顯著[4-7]。本課題前期研究證實，黑番茄對慢性前列腺炎及性機能有明顯的改善作用。2003年甘肅大漠紫光生物科技有限公司與美國技術合作后，在2008年成為了繼德國、美國之后全球第3個種籽生產基地，并向國內外提供鮮果生產的優質種籽，于2010年建成了全球首條黑番茄生產加工線。隨著其營養價值被認知以及經濟與環保價值的顯現，種植范圍越來越廣，研究越來越多[4,8]，但到目前為止尚無黑番茄功效成分分析的報道，本研究以甘肅大漠紫光生物科技有限公司提供的黑番茄濃縮漿為實驗材料，建立其指紋圖譜，測定主要化學成分，為該產品的質量控制及其后續功效評價奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010 CHT高效液相色譜儀，LC/Labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；ME235S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-5200DE數控超聲波發生器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥沒食子酸(批號110831-201605，質量分數90.8%)、綠原酸(批號110753-201415，質量分數96.2%)、阿魏酸(批號110773-201614，質量分數99.0%)、白藜蘆醇(批號111535-201703，質量分數99.4%)、槲皮素(批號100081-201610，質量分數99.8%)、木犀草素(批號111520-201605，質量分數99.6%)和山柰酚(批號110861-201611，質量分數95.5%)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；黑番茄濃縮漿(500 g·袋-1)，批號:20170606(S1)，20170607(S2)，20170608(S3)，20170609(S4)，20170610(S5)，20170611(S6)，20170612(S7)，20170613(S8)，20170614(S9)，20170615(S10)，由甘肅大漠紫光生物科技有限公司提供；乙腈、甲醇，色譜級，美國Honeywell公司；超純水，自制。

2 指紋圖譜的測定方法與結果

2.1色譜條件色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～50 min，95%→90%B；50～100 min，90%→85%B；100～120 min，85%→60%B；120～135 min，60%→30%B；135～140 min，30%→0%B。記錄時間為140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取綠原酸對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中,加體積分數為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液(參比物溶液)。

2.2.2供試品溶液精密稱取本品濃縮漿10.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分數為90%的甲醇10 mL，將錐形瓶密塞后稱定質量，超聲處理(功率250 kW，頻率40 kHz)30 min，放冷后再稱定質量，加入體積分數為90%的甲醇補足減失的質量，振勻,濾過，取續濾液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，連續進樣6次，分別對樣品中30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析。結果顯示，30個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，結果表明，儀器精密度良好。

2.3.2穩定性實驗吸取2.2.2項下方法制備供試品溶液(批號20160606)，分別于0，3，6，9，15和24 h進樣，對樣品譜圖中30個共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。結果顯示，樣品色譜圖中30個共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3重復性實驗取6份供試樣品(批號20170606)，按照2.2.2項下方法制備的供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行分析，分別對譜圖中30個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積進行分析。結果顯示，30個共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0 %和3.0 %，結果表明，該方法重復性良好。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度分析取10批黑番茄樣品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為20 μL，記錄指紋圖譜，見圖1。由圖1可知，圖譜中峰11為綠原酸，即參比物，以此建立指紋圖譜。10批樣品的譜圖中，30個共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值分別小于2.0%和3.0%，與指紋圖譜研究技術的相關要求相符合，見圖1至圖2[9-10]。通過運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A)對10批黑番茄濃縮漿的指紋圖譜進行相似度分析，結果顯示，通過對選定的30個共有色譜峰進行譜峰匹配，得出了樣品指紋圖譜的共有模式。譜圖中各峰整體相似度為0.972～0.995；結果表明，這10批黑番茄濃縮漿中的化學成分具有良好的一致性。

圖1黑番茄濃縮漿HPLC指紋圖譜

1～30.特征指紋峰；1.沒食子酸；11.綠原酸；17.阿魏酸；18.木犀草素；21.白藜蘆醇；24.槲皮素；26.山柰素。

Fig.1 Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

1-30.characteristic fingerprint peaks；1.gallic acid； 11.chlorogenic acid；17.ferulic acid；18.luteolin；21.resveratrol；24.quercetin；26.kaempferol.

圖210批黑番茄濃縮漿的HPLC指紋圖譜

Fig.2 10 batches of Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

3 含量測定方法與結果

3.1色譜條件色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)；梯度洗脫同2.1項下。記錄時間為140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：325 nm；進樣量：20 μL。

3.2混合對照品溶液的制備分別精密稱取阿魏酸、木犀草素和山柰酚5.1，5.0和5.2 mg，置于同一25 mL量瓶中，加體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液為A溶液；另精密稱取沒食子酸、綠原酸、白藜蘆醇和槲皮素9.6，26.0，5.0和 7.5 mg，置于同一25 mL量瓶中，精密加入A溶液1 mL，再加入體積分數為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，得沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚對照品質量濃度分別為350.00，1 000.00，20.00，20.00，200.00，300.00和20.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。

3.3供試品溶液的制備同2.2.2項下方法進行制備。

3.4線性關系分別精密量取3.2項下制備的混合對照品溶液0.01，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 mL，分別置于1 mL量瓶中，加入體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣。以各對照品的質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，計算，得線性方程，見表1，色譜圖見圖3。結果表明，各對照品在相應質量濃度范圍內呈良好的線性關系。

表1對照品的線性方程及其質量濃度范圍

Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substance

對照品名稱線性范圍/μg·mL-1線性方程 r沒食子酸3．50～350．00y1=602．97x1+530．470．9996綠原酸10．00～1000．00y2=32213x2-609750．9996阿魏酸0．20～20．00y3=66388x3-5008．600．9993木犀草素0．20～20．00y4=14113x4-662．180．9995白藜蘆醇2．00～200．00y5=78161x5-118070．9997槲皮素3．00～300．00y6=38184x6+2528．900．9997山柰酚2．00～20．00y7=25492x7-2451．500．9996

3.5精密度實驗精密吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，重復進樣5次，測得沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的RSD值分別為1.00%，0.75%，1.12%，0.89%，0.96%，0.93%和0.81%，結果表明，該方法精密度良好。

圖3混合對照品HPLC圖譜

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.3 Mixed reference substance HPLC fingerprint

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol；6.quercetin；7.kaempferol.

3.6穩定性實驗精密吸取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號20170606)，分別在第0，2，4，8，12和24 h進樣。結果沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面積的RSD值分別為0.82%，0.92%，0.83%，0.87%，0.95%，0.77%和0.81%，結果表明，該溶液在24 h內穩定性良好。

3.7重復性實驗精密稱取6份供試品(批號20170606)，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照3.1項下色譜條件進樣測定分析。結果表明，6份供試品中沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量分別為55.81，360.87，0.98，24.51，84.58，1.03和0.76 μg·g-1，RSD值分別為0.98%，1.05%，1.0%，1.04%，1.06%，0.92%和1.11%，結果表明，該方法重復性良好。

3.8加樣回收率實驗精密稱取黑番茄濃縮漿(批號20170606)4.0 g，分別添加混合對照品溶液(精密稱取沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚適量，制成每1 mL體積分數為70%的甲醇中分別含上述物質110.00，730.00，2.00，50.00，170.00，2.10和1.50 μg的混合對照品溶液)，再加入體積分數為70%的甲醇定容至刻度，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按照3.1項下色譜條件進樣測定，見表2。結果表明，該方法回收率良好。

表2加樣回收率測定結果

Tab.2 Results of sample recovery test

化合物樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%沒食子酸2．01240．11230．08800．198197．4399．370．772．02530．11300．08800．200299．012．03820．11380．11000．2239100．142．00110．11170．11000．220498．812．06400．11520．13200．2501102．172．00690．11200．13200．242298．66綠原酸2．01240．72620．58401．290496．6197．280．462．02530．73090．58401．303998．132．03820．73550．73001．449997．852．00110．72210．73001．421695．822．06400．74480．87601．609798．732．00690．72420．87601．569996．54阿魏酸2．01240．00200．00160．003596．7496．490．922．02530．00200．00160．003597．202．03820．00200．00200．004098．132．00110．00200．00200．003893．952．06400．00200．00240．004498．222．00690．00200．00240．004294．72白藜蘆醇2．01240．04930．04000．087595．4796．230．642．02530．04960．04000．087795．202．03820．05000．05000．098396．712．00110．04910．05000．096995．772．06400．05060．06000．109798．472．00690．04920．06000．106795．77槲皮素2．01240．17020．13600．303197．6898．360．542．02530．17130．13600．306499．312．03820．17240．17000．341199．252．00110．16930．17000．333496．562．06400．17460．20400．3790100．182．00690．16970．20400．368097．19木犀草素2．01240．00210．00170．003795．6796．760．692．02530．00210．00170．003796．072．03820．00210．00210．004197．172．00110．00210．00210．004196．142．06400．00210．00250．004698．972．00690．00210．00250．004596．54山柰酚2．01240．00150．00120．002798．3899．690．632．02530．00150．00120．0027100．062．03820．00160．00150．0031101．402．00110．00150．00150．003097．942．06400．00160．00180．0034101．192．00690．00150．00180．003399．15

3.9含量測定精密量取10批供試品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照3.1項下色譜條件進樣分析。各批樣品中沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量及RSD值分別見圖4和表3。

圖4黑番茄濃縮漿樣品HPLC圖

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.4 HPLC fingerprint of Black tomato concentrated sauce samples

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol； 6.quercetin；7.kaempferol.

表3 10批黑番茄濃縮漿中7個成分含量測定結果

4 討論

采用二極管陳列檢測器全波長對黑番茄濃縮漿樣品進行檢驗測定，依據三維色譜圖，以及對各對應波長下峰的信息量的比較，結果表明，波長為280 nm時峰的信息量較多，故將其作為該HPLC指紋圖譜的定性波長[11-14]；而在325 nm波長處時沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚7個化合物與相鄰各峰之間的分離度均≥1.5[15]，故將其作為該HPLC法測定7個化合物的定量波長。由于該保健食品成分復雜，等度洗脫難以充分洗脫，故采用梯度洗脫的方法。通過對不同流動相系統乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水進行比較，結果顯示，乙腈-1.0 g·L-1磷酸水溶液為理想流動相[16]。本制劑為果漿，選用溶劑為不同體積分數的甲醇(50%，60%，70%，80%，90%和100%)，結果顯示使用體積分數為90%的甲醇時分離較佳；采用不同時間(10，15，20，30，40，50和60 min)超聲或加熱回流，結果顯示超聲30 min較理想。對不同柱溫與流速進行比較，顯示柱溫超過或低于30 ℃時，譜圖中大部分色譜峰分離度小或不能分開；當流速高于或低于0.8 mL·min-1時，大部分色譜峰的分離度差；色譜記錄時間，在140 min之后，無色譜峰出現。因此，選擇便于控制的柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1和記錄時間140 min。

綜上所述，通過對10批次的黑番茄濃縮漿樣品進行相似度計算分析，結果顯示相似度數值為0.972～0.995。同時，樣品中7種成分的定量結果顯示，各批次樣品中上述7種成分的含量均一且穩定。表明筆者建立的黑番茄濃縮漿的HPLC指紋圖譜方法與含量測定方法，具有良好的分析及評價能力，具有簡便、穩定可靠、準確等明顯優勢。因此，該方法可用于黑番茄濃縮漿化學成分的含量檢測，其指紋圖譜適用于該保健食品的質量控制等評價方法。

參考文獻：

[1] 鄭曉艷，王正武.復合保健黑番茄醬的研究[J].食品研究與開發，2016，37(2):70-73.

[2] 施慶華，陳建平，蔡立旺，等.江蘇沿海地區黑番茄品種比較試驗[J].長江蔬菜：學術版，2011，(20):47-49.

[3] 趙煜，張懷予，彭濤，等.黑番茄飲料加工及氧化穩定性的初步研究[J].農產品加工：學刊，2014,(2):17-20.

[4] 張哲奇，龐雪瀅，榮紅國，等.黑番茄營養成分分析及營養評價[J].營養學報，2013，35(5):516-518.

[5] 王秀梅，張洪永，賈瑞.美國櫻桃黑番茄優質高產栽培技術[J].長江蔬菜.2012,26(7):23-25.

[6] 曹華.番茄中的極品——黑珍珠[J].蔬菜，2010,(5):15-17.

[7] 范仲先.美國黑番茄及其栽培技術[J].新農村，2009,(8):18.

[8] 郝琴，田開亮，于長青.黑番茄及其深加工技術淺析[J].糧食與食品工業，2012，19(5):35-37.

[9] 楊方良，張晶，孫國祥，等.中藥組方指紋圖譜研究方法和思路[J].色譜，2016，34(7):715-725.

[10]甄漢深，范秀春，丘琴，等.中藥指紋圖譜研究的一些問題探討[J].時珍國醫國藥，2015，26(8):1960-1961.

[11]劉青，杜守穎，多吉仁青，等.HPLC法同時測定不同產地大花紅景天中6種活性成分[J].中草藥，2015，46(2):276-279.