紅花清肝十三味對CCl4 誘導大鼠肝損傷纖維化的作用

楊宏昕，白音夫，常 亮，金 輝，魏艷沛，董珉翔，米裕青，劉 靜

(1.內蒙古自治區人民醫院，呼和浩特 010065；2.內蒙古自治區中醫藥研究所，呼和浩特 010020；3.內蒙古自治區國際蒙醫醫院，呼和浩特 010065；4.內蒙古自治區監獄管理局第一醫院，呼和浩特 010050)

紅花清肝十三味(國藥準字Z15020395，蒙藥名為古日古木-13)是治療肝病的蒙成藥，在中華人民共和國衛生部藥品標準蒙醫分冊中收錄[1]，由紅花、丁香、蓮子、麥冬、木香、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、人工麝香、水牛角濃縮粉、人工牛黃和銀朱組成，為肝熱癥[2]主要方劑，具有清肝熱、解毒作用，主治肝功衰退和腰腎損傷。臨床報道，紅花清肝十三味治療淤膽型肝炎有效率為86.6%[3]，治療酒精性肝病有效率為96%[4]，治療乙型肝炎有效率為93%[5]，治療脂肪肝有效率為91%[6]，對藥物性肝炎、病毒性肝炎也有較好的療效[7]。但紅花清肝十三味(HHQG)對實驗性肝損傷的作用報道較少。本文采用CCl4制備大鼠肝損傷模型，考察不同劑量HHQG對CCl4引起大鼠肝損傷及纖維化的防治作用，探討其可能的機制，為蒙藥抗肝損傷藥物的應用開發提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 TGL-16型高速離心機(上海醫用分析儀器廠)；BA210型光學顯微鏡(麥克奧迪有限公司)；210紫外分光光度計(日本島津公司)；DNM-9602酶聯免疫檢測儀(北京普朗新技術有限公司)；42型半自動生化儀(英國BECKMAN公司)。

1.2試藥 紅花清肝十三味(HHQG，內蒙古蒙藥有限公司，批號1606028)；聯苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業有限公司，批號20151113)；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒 (中生北控生物科技股份有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽酶(GSH) (南京建成生物工程研究所)；基質金屬蛋白酶原-1(MMP-1),基質金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)試劑盒(上海海研醫學生物技術有限公司)。

1.3動物 Wistar大鼠，國家二級標準動物，SCXK(蒙字)2002-0001，雌雄各半，3周齡，體質量為90～110 g，由內蒙古大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1模型的制備與分組 取大鼠50只，室溫20～24 ℃、濕度70%的環境下飼養，標準飼料和自由飲水，喂養1周，記錄體質量。將大鼠分為對照組、模型組、陽性對照組(LBSZ 0.1 g·kg-1)和實驗藥物高、低劑量組(HHQG 2和0.2 g·kg-1)，每組10只，按照每100 g體質量2 mL 灌胃給藥，對照組和模型組用等體積蒸餾水灌胃。除對照組外，其他各組動物按照文獻方法[8]，以體積分數為25%四氯化碳(CCl4)玉米油溶液1 mL·kg-1，每隔4 d 皮下注射1次，共計20次。所有大鼠在整個實驗期間均喂標準飼料，自由飲水。第1次注射后開始灌胃給藥，對照組、HHQG高劑量組和低劑量組，每日1次；實驗結束后，動物禁食12 h，乙醚麻醉，腹主動脈收集血液，切取肝臟。

2.2肝體指數測定 取完整肝臟稱定質量，計算肝臟與體質量的比值。

2.3肝組織病理學觀察 從肝大葉處切下0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的肝組織，用100 mL·L-1的甲醛固定。將固定好的肝組織做組織切片，HE染色，光鏡觀察肝臟組織病理學變化。

2.4血清酶測定 取血液，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清，測定AST、ALT和LDH含量，按照試劑盒說明書操作。

2.5肝組織勻漿檢測 剪取一塊肝組織于預冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，分別稱取0.1 g 放入勻漿管，加入9 倍預冷生理鹽水，采用勻漿器研磨后，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，制備成質量濃度為10 g·L-1的組織勻漿，用分光計測定SOD、GSH和MDA，酶聯免疫檢測儀測定MMP-1和TIMP-1，按照試劑盒說明書操作。

3 結果

3.1肝體指數測定 對照組大鼠肝體指數與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，LBSZ組與HHQG高劑量組肝體指數明顯低于模型組(P<0.05)，HHQG低劑量組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1各組大鼠體質量和肝體指數的變化

組別體質量/g肝體指數/mg·g-1對照組296．34±34．230．23±0．07模型組274．76±35．270．31±0．08?LBSZ組285．23±38．270．26±0．07??HHQG高劑量組289．47±33．260．27±0．07??HHQG低劑量組281．58±37．230．29±0．09

注：與對照組比較*P<0.05；與模型組比較**P<0.05。

3.2對肝損傷病理變化的觀察 見圖1。由圖1A可知，對照組肝組織形態、結構正常，肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，形態大小一致，肝索呈明顯的放射狀，匯管區無腫脹、脂變壞死和血管周圍無炎細胞浸潤與纖維化等病變；由圖1B可知，模型組肝組織呈多發性變性和壞死，肝細胞索排列紊亂，細胞混濁腫脹，空泡樣變性，枯否氏細胞增多，血竇擴張、瘀血，部分細胞核消失，細胞膜不完整，結構混亂，纖維化增生；由圖1C可知，LBSZ組肝小葉較完整，匯管區比較清晰，血管周圍見炎細胞浸潤，肝細胞變性、壞死，與模型組相比較，肝損傷明顯減輕；由圖1D可知，HHQG高劑量組肝小葉較完整，肝細胞濁腫變性輕于模型組，纖維增生不明顯，匯管區見炎細胞浸潤，與模型組比較，肝損傷明顯減輕；由圖1E可知，HHQG低劑量組肝細胞索排列紊亂，細胞混濁腫脹，細胞水腫和脂肪樣變，炎細胞浸潤，程度與模型組接近。結果表明，HHQG組對CCl4所引起的肝損傷具有改善作用。

3.3對血清酶的影響 對血清酶測定表明，模型組中ALT和AST和LDH含量與對照組比較均明顯升高(P<0.05)，LBSZ組中ALT、AST含量均明顯低于模型組(P<0.05)，HHQG高劑量組中ALT、AST和LDH含量均明顯低于模型組(P<0.05)，HHQG低劑量組對ALT、AST和LDH含量無明顯影響(P>0.05)。見表2。

圖1大鼠肝損傷病理變化(HE×40)

A.對照組；B.模型組；C.LBSZ組；D.HHQG高劑量組；E.HHQG低劑量組。

Fig.1 Rat liver injury pathological changes (HE×40)

A.control group；B.model group；C.LBSZ group；D.HHQG high dose group；E.HHQG low dose group.

表2各組大鼠血清酶的比較

組別ALT/U·L-1AST/U·L-1LDH/U·L-1對照組68．26±15．72221．15±32．3134．33±8．63模型組156．77±22．49?325．11±47．28?59．21±12．31?LBSZ組98．45±20．70??285．53±38．18??47．78±11．22HHQG高劑量組112．31±21．31?274．31±35．41??43．76±10．73??HHQG低劑量組145．21±25．86298．65±43．2054．33±13．39

注：與對照組比較*P<0.05；與模型組比較**P<0.05。

3.4對肝組織勻漿中脂質過氧化的影響 結果表明，對照組大鼠肝勻漿組織中SOD和GSH水平明顯高于模型組(P<0.05)，MDA明顯低于模型組(P<0.05);LBSZ組中MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)；HHQG高劑量組中SOD和GSH水平明顯高于模型組 (P<0.05)，MDA 水平明顯低于模型組(P<0.05)；HHQG低劑量組中SOD、GSH和MDA 水平與模型組比較無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3各組大鼠肝組織勻漿脂質過氧化作用的的比較

組別SOD/U·mg-1MDA/nmol·mg-1GSH/ng·mg-1對照組121．2±34．6?12．4±1．3?238．4±45．2?模型組194．7±42．517．8±2．4211．3±51．9LBSZ組146．2±45．6?14．3±2．3?228．7±51．7?HHQG高劑量組133．1±55．3?15．6±2．5?221．8±46．1?HHQG低劑量組169．1±58．718．5±3．6210．4±51．2

注：與對照組比較*P<0.05；與模型組比較**P<0.05。

3.5對肝組織勻漿中基質金屬蛋白酶的影響 模型組與對照組比較，MMP-1水平明顯降低(P<0.05)，TIMP-1水平明顯升高(P<0.05)，MMP-1/TIMP-1比值明顯降低(P<0.05)；LBSZ組與模型組比較，TIMP-1水平明顯降低(P<0.05)，MMP-1水平無明顯變化(P>0.05)；HHQG高劑量組與模型組比較，MMP-1水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1水平明顯降低(P<0.05)，MMP-1/TIMP-1比值明顯升高(P<0.05)；HHQG低劑量組與模型組比較，MMP-1、TIMP-1水平與MMP-1/TIMP-1比值無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4各組大鼠肝勻漿中MMP-1與TIMP-1的變化

組別MMP?1(A)TIMP?1(A)MMP?1/TIMP?1對照組0．150±0．0250．055±0．0112．73模型組0．104±0．021?0．067±0．015?1．20LBSZ組0．119±0．0280．062±0．013??1．92HHQG高劑量組0．120±0．023??0．060±0．011??2．00HHQG低劑量組0．112±0．0210．079±0．0161．26

注：與對照組比較*P<0.05，與模型組比較**P<0.05。A表示吸光度、光密度。

4 討論

CCl4中毒大鼠肝細胞變性和后期纖維化[9]，脂質過氧化是其主要的肝損傷形成機制[10]。CCl4進入肝細胞后，被肝微粒體酶和細胞色素P450 激活生成三氯甲基自由基和氯自由基，通過氫鍵的吸附作用攻擊細胞膜磷脂質上的不飽和脂肪酸，使蛋白質變性交聯，引起膜結構的破壞，引起肝細胞病理性損傷[11]，細胞外基質的增生與降解失去平衡，導致肝臟內纖維結締組織異常沉積形成纖維化。

研究表明，實驗性大鼠在CCl4作用下肝細胞出現病理性改變，血清酶升高，肝組織勻漿中SOD、GSH與MDA氧化與抗氧化平衡系統破壞；同時伴有細胞外基質蓄積，并伴有TIMP-1表達增加，MMP-1表達下降，表明細胞外基質合成增加分解下降，肝纖維化啟動[12]。

MDA是脂質過氧化的終產物，不僅能反映機體內氧化反應水平，也能作為損害因子對機體進行攻擊[13]。SOD廣泛存在于生物細胞中的重要金屬結合酶，能清除氧自由基而起到保護細胞的作用，其含量與體內活性氧負相關[14-15]，GSH是以半胱氨酸、谷氨酸與甘氨酸為原料的三肽酶，參與體內氧化還原過程，對脂自由基及脂質過氧化自由基等基團具有較強的清除作用，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞[16]；MMP-1與TIMP-1等細胞因子對肝損傷后的細胞外基質分解與合成起到調節作用，對肝纖維化發生具有重要作用[17-18]。高劑量HHQG可提高大鼠肝組織SOD與GSH水平，抑制MDA生成，通過降低肝組織的脂質過氧化，保護肝組織、降低肝細胞損傷程度及壞死程度，減少ALT、AST和LDH釋放；肝損傷MMP-1的作用減弱，TIMP-1的作用增強，細胞外基質分泌增強，分解減弱。HHQG調控MMP-1與TIMP-1平衡，從而減少細胞外基質合成分泌，達到調控肝纖維化的作用。

此外，HHQG主治蒙醫的肝熱證[2]。肝熱證包括肝損傷及纖維化的動態病理過程，肝熱證早期(損傷期)毒黏外襲、肝氣郁結，肝熱證晚期(纖維化期)肝郁血瘀，兼肝腎不足。由此清熱解毒、活血化瘀兼補肝腎是HHQG的治療原則。HHQG從臨床實踐中可知，清熱藥、解毒藥和活血化瘀藥可以抗病毒與抗脂質過氧化，終止氧化應激的鏈式反應，抑制膠原蛋白合成、促進分解[19-20]；HHQG以不同性味配伍通過多靶點途徑達到抗肝損傷，調節肝纖維化的作用；上述為HHQG對肝熱證的蒙醫藥辨證論治的理論和臨床依據，另外，在蒙醫藥理論指導的處方配伍，藥物之間的相互作用，降低了毒性藥材的毒性，臨床使用未見不良反應的報道。

綜上所述，HHQG抗肝損傷是通過抗脂質過氧化實現的，同時通過對MMP-1與TIMP-1細胞因子平衡達到調節肝纖維化作用。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準:蒙藥分冊[S].1998：99.

[2] 白清云.中國醫學百科全書蒙醫學[M].上海：上海科學技術出版社，1992:204.

[3] 郝新芳.紅花清肝十三味丸治療瘀膽型肝炎60例[J].醫藥論壇雜志，2005，26(3)：52，54.

[4] 娜仁花.蒙醫蒙藥十三味紅花散治療酒精性肝炎40例[J].中國中醫藥現代遠程教育，2013，11(8)：30-31.

[5] 秦學，王銀虎.蒙藥古日古木13味丸治療急性黃疸型肝炎的療效觀察[J].中國民間療法，2015，23(3)：68-69.

[6] 寶玉，郭永勝.蒙藥古日古木-13味治療脂肪肝32例[J].中國民族醫藥雜志，2006，13(3)：16.

[7] 曹·其木格.蒙藥古日古木-13治療藥物性肝損害[J].中國民族醫藥雜志，2008，14(9)：3.

[8] 楊宏昕，白音夫，米裕青，等.蒙古山蘿卜酸對實驗性肝纖維化大鼠MMP-1、TIMP-1、TGF-β1和PDGF表達的影響[J].西北藥學雜志，2017，32(4)：477-480.

[9] 劉赴平，師玲玲.四氯化碳造成急性肝損傷大鼠模型的實驗研究[J].中國輸血雜志，2012，25(5):446-448.

[10]Lin X，Huang R，Zhang S，et al.Methyl helicterate protects against CCl4-induced liver injury in rats by inhibiting oxidative stress，NF-κB activation，Fas/FasL pathway and cytochrome P4502E1 level[J].Food Chem Toxicol，2012，50(10):3413-3420.

[11]Pinto C，Duque A L，Rodríguez-Galdón B，et al.Xanthohumol prevents carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats[J].Food Chem Toxicol，2012，50(10):3405-3412.

[12]姜憲輝，葉華，孫雷.MMP-1、TIMP-1 在肝纖維化組織中的表達及其病理意義[J].醫學信息，2008，21(12):2291-2293.

[13]郭又嘉，文坎，張士軍，等.玉郎傘皂苷對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的影響[J].中國藥理學通報，2012，28(4):554-558.

[14]莫簡.醫用自由基生物學導論[M].北京：人民衛生出版社，1989：204-213.

[15]王君明，崔瑛，王崢濤，等.超氧化物歧化酶參與肝損傷的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(7)：265-267.

[16]Anand K V，Anandhi R，Pakkiyaraj M，et al.Protective effect of chrysin on carbon tetrachloride (CCl4)-induced tissue injury in male Wistar rats[J].Toxicol Ind Health，2011，27(10):923-933.

[17]艾迎春，遲男男.肝硬化大鼠血清MMP-3、TIMP-1的表達水平與肝硬化進程的研究[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3):53-54.

[[18]聶青和，周永興，謝玉梅.肝硬化病人血清、肝組織中金屬蛋白酶組織抑制因子的表達及意義[J].中華醫學雜志，2001，81(13):805-807.

[19]劉亞鋒.氧化應激與肝臟保護[J].胃腸病學和肝病學雜志，2011，20(7):594-596.

[20]曉紅，白音夫.植物藥有效成分抗肝纖維化研究[J].中國民族醫藥雜志，2009，15(8)；38-39.