樂安眠茶水溶性成分的HPLC指紋圖譜及2種成分的溶出度研究

雷美娜，肖會敏，何 悅，王四旺

(空軍軍醫大學藥物研究所，西安 710032)

樂安眠茶又稱清心安神桂仁茶，是由炒酸棗仁、茯苓、蓮子、龍眼肉和百合5味藥食同源的中藥制成，主要作用是清心安神。炒酸棗仁為方中君藥，有養心補肝、寧心安神和斂汗生津的功效，含有的酸棗仁總皂苷、總黃酮等成分，具有催眠、鎮靜作用[1]；茯苓可利水滲濕、健脾寧心[1]；蓮子有補脾止瀉、止帶、養心安神、益腎澀精的功效[1]；龍眼肉具有補益心脾、養血安神的功效[1]；百合可養陰潤肺、清心安神[1]。酸棗仁總黃酮可明顯抑制小鼠的自發活動，拮抗咖啡因誘發的小鼠精神運動性興奮，故認為總黃酮系酸棗仁中中樞抑制作用的主要有效成分，其中斯皮諾素為酸棗仁總黃酮中的主要有效成分[2-3]。腺苷是生物小分子化合物，藥用價值顯著，具有抗病毒、抗凝血、擴張冠狀動脈、鎮靜中樞神經和抗心率不齊等作用，為龍眼肉中鎮靜安神的主要成分[4-6]。經文獻檢索未發現該茶劑的研究報道。因此，本文運用HPLC法對該茶劑水溶性成分進行分析，建立HPLC指紋圖譜，測定斯皮諾素及腺苷的含量及不同泡茶時間二者的溶出度。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Prominence UFLC，島津高效液相色譜儀(配LC-20AD雙泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20ACHT自動進樣器)，LC/labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；KQ-300DE數控超聲波發生器(昆山超聲儀器有限公司)；BSA124S電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2試藥 斯皮諾素對照品(批號111869-201203，質量分數以95.4%計)，腺苷對照品(批號2110879-200202，質量分數以99.7%計)，均購自中國食品藥品檢定研究院；炒酸棗仁、茯苓、蓮子、百合和龍眼肉藥材，均購自西安藻露堂集團藻露堂藥業有限公司；樂安眠茶(批號：S1：20161106，S2：20161107，S3：20161108，S4：20161109，S5：20161110，S6：20161111，S7：20161112，S8：20161113，S9：20161114，S10：20161115)，由陜西含光生物科技有限公司研制并提供；乙腈、甲醇，色譜級，美國Fisher公司；超純水，純水儀購自美國Millipore公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 nm×4.6 mm，5 μm)。流動相：甲醇(A)-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(B)(5∶95),高壓梯度洗脫程序：0～10 min，B 95%→90%；10～60 min，B 90%→40%；60～65 min，B 40%；65～65.1 min，B 40%→0%；65.1～70 min，B 0%；70～70.1 min，B 0%→95%；70.1～75 min，B 95%，記錄時間為60 min。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：50 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取斯皮諾素對照品和腺苷對照品11.01和5.12 mg，置于同一25 mL量瓶中，加體積分數為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液 取3袋樂安眠茶劑，混合并研細，精密稱取4.5 g，置于100 mL的溫水中超聲處理30 min，濾過，取濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3陰性對照溶液

2.2.3.1酸棗仁陰性對照溶液 按照處方比例精密稱取缺酸棗仁的陰性對照茶劑4.5 g，置于100 mL溫水中，超聲處理30 min，濾過，取濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3.2龍眼肉陰性對照品溶液 按照處方比例精密稱取缺龍眼肉的陰性對照茶劑4.5 g，置于100 mL溫水中超聲處理30 min，濾過，取濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3指紋圖譜的測定

2.3.1精密度實驗 取樂安眠茶劑3袋(批號20161106)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，連續進樣6次，每次50 μL，分別對各共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析。經計算得出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別小于2.45%和2.62%，結果表明，該儀器精密度良好。

2.3.2穩定性實驗 取樂安眠茶劑3袋(批號20161106)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，分別于0，2，4，8和12 h進樣，分析共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別小于1.0%和2.00%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.3重復性實驗 取樂安眠茶劑6份(批號20161106)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，結果顯示各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別小于0.85%和2.80%，結果表明，該方法重復性良好。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度評價 取10批供試樣品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。共選定31個共有峰，其中峰11確定為腺苷，峰25為斯皮諾素，峰26為蘆丁[7-8]，由于峰26分離度較差，峰面積小，故選用腺苷和斯皮諾素為參比物建立樂安眠茶水溶性成分的指紋圖譜[9-11]。10批供試品共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于2.00%，見圖2。符合相關要求。運用文獻要求對各批樣品的指紋圖譜進行相似度分析[12]，對選定的31個共有色譜峰進行譜峰匹配，通過計算得出樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標準，進行整體相似度評價，結果相似度為0.993～0.997，結果表明，各樣品的化學成分一致性較好。

圖1樂安眠茶HPLC指紋圖譜

1～31. 特征指紋峰；11.腺苷；25.斯皮諾素(作為參照物的色譜峰)。

Fig.1 HPLC fingerprint of Leanmian Tea

1-31.characteristic fingerprint peak;11.adenosine；25.spinosin(reference peak).

圖210批樂安眠茶的HPLC指紋圖譜

Fig.2 10 batches of Leanmian Tea HPLC fingerprint

2.4含量測定

2.4.1線性范圍 精密吸取對照品溶液0.015，0.030，0.040，0.050，0.060，0.100和0.150 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，分別吸取各質量濃度溶液50 μL進樣，按照2.1項下色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(y)、對照品溶液質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)，繪制標準曲線，計算得斯皮諾素線性回歸方程y=67 703x-67 517，r=0.999 5(n=2)；腺苷線性回歸方程y=181 733x+5 185.5，r=0.999 4 (n=2)。結果表明，斯皮諾素和腺苷質量濃度分別在3.15～31.50和1.53～15.3 μg·mL-1范圍內呈良好線性關系。

2.4.2專屬性實驗 取斯皮諾素對照品溶液、供試品溶液、酸棗仁陰性對照溶液、腺苷對照品溶液和龍眼肉陰性對照溶液各50 μL，進樣，按照2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖3。由圖3可知，分離良好，且陰性對照無干擾，結果表明，該方法專屬性良好。

圖3HPLC圖

A.混合對照品；B.樂安眠茶；C.酸棗仁陰性對照；D.龍眼肉陰性對照；1.腺苷；2.斯皮諾素。

Fig.3 HPLC chromatograms

A．mixed reference substances；B.Leanmian Tea；C.Ziziphispinosaesemen negative control；D.DimocarpuslonganLour.negative control；1.adenosine；2.spinosin.

2.4.3精密度實驗 精密量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得，用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別取50 μL進樣，按照2.1項下色譜條件測定峰面積，連續進樣5次。測得斯皮諾素和腺苷峰面積的RSD值分別為0.10%和0.21%，結果表明，該儀器精密度良好。

2.4.4穩定性實驗 精密量取2.2.1項下制備的混合對照品溶液 0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別于0，1，2，4，6，8和12 h進樣，每次進樣50 μL，按照2.1項下色譜條件測定峰面積，測得斯皮諾素和腺苷峰面積的RSD值分別為0.19%和0.15%。結果表明，該樣品在12 h內穩定。

2.4.5重復性實驗 精密稱取供試樣品6份(批號20161107)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，測得斯皮諾素和腺苷的平均含量分別為0.062 4和0.058 1 mg·g-1，RSD值分別為1.76%和1.09%，結果表明，該方法重復性良好。

2.4.6加樣回收實驗 取供試樣品6份(批號20161107)，研細，取3 g，分別精密量取并添加0.40，0.40，0.47，0.47，0.57和0.57 mL混合對照品溶液(精密稱取斯皮諾素和腺苷對照品10.50和9.50 mg，置于同一25 mL量瓶中，用體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，見表1。結果表明,該方法回收率良好。

表1加樣回收率測定結果

Tab.1 Results of recovery test

化合物名稱取樣量/g原有量/mg添加量/mg測出量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%斯皮諾素2．90970．180．170．345397．235398．230．923．20810．200．170．365497．29413．12010．190．200．387898．90003．24860．200．200．396698．30003．07150．190．240．425498．08333．27890．200．240．438999．5417腺苷2．90970．170．140．304996．3696．240．893．20810．190．140．325796．933．12010．180．180．355197．283．24860．190．180．361495．223．07150．180．220．392196．413．27890．190．220．399595．23

2.4.7樣品的含量測定 精密稱取10批樣品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定。各批樣品中斯皮諾素和腺苷的平均含量分別為0.083 4和0.059 1 mg·g-1，RSD值分別為1.22%和1.13%。

2.5不同泡茶時間斯皮諾素的溶出度測定 測定方法依據2.1項下色譜條件與相關文獻方法[13]：精密稱取1袋供試品，加入溫水100 mL浸泡，分別于浸泡5，10，15，30，40，50，60，90和120 min時取樣，并按照2.1項下色譜條件測定峰面積，根據線性方程計算水提液中斯皮諾素的含量，結果見表2。

表2 斯皮諾素溶出情況測定結果

3 討論

3.1指紋圖譜的測定

3.1.1樣品制備方法的選定 為研究樂安眠茶劑的水溶性成分，通過篩選得出：精密稱取4.5 g該茶劑，用100 mL溫水超聲30 min，過濾，取濾液，作為供試品，得到的HPLC圖各峰分離度良好，且峰面積在線性范圍內，故選定HPLC法作為制樣方法，以此對樂安眠茶水溶性成分的指紋圖譜及斯皮諾素、腺苷的含量測定進行研究。

3.1.2流動相的選定 曾選用乙腈-水(15∶85)、甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(5∶95)作為流動相，但分離效果不理想，最終采用甲醇-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95)作為流動相進行梯度洗脫，各峰分離度良好，峰形較好[14-15]。

3.1.3波長的選定 參考文獻[16-18]，參比物斯皮諾素的最大吸收波長為335 nm，腺苷的最大吸收波長為260 nm，但在335 nm波長下出峰較少，且各峰分離度較差，故選用190，245，260，270和300 nm下考察各自波長下的色譜圖，經比較發現在260 nm波長下各峰分離度良好，且斯皮諾素和腺苷的峰形較好，故選用260 nm作為檢測波長。

3.1.4參比物的選擇 本文前期通過對31個共有峰的考察確定了峰11，25和26分別為腺苷、斯皮諾素和蘆丁，但由于蘆丁含量少，且分離度差，故選用腺苷和斯皮諾素作為參比物。

3.1.5其他條件的選擇 將不同柱溫(25，30，35和40 ℃)下的色譜圖進行比較，發現35 ℃時峰的分離度較好，故確定柱溫為35 ℃；進樣量為50 μL時各峰特征性強，峰形較好，故確定進樣量為50 μL[19-20]。

3.2樣品含量測定 通過考察可得指紋圖譜測定中的溶液制備方法及測定條件對斯皮諾素及腺苷的含量測定同樣適用。因腺苷和斯皮諾素的含量穩定且分離度較好，故選定腺苷和斯皮諾素2種成分進行含量測定分析。

3.3樣品溶出度測定

3.3.1樣品制備方法的選定 由于本品為保健茶劑，服用方法為溫水浸泡后飲用，故對該茶劑不同泡水時間內斯皮諾素和腺苷的含量比較研究時選用開水浸泡的方法。經考察得出，1袋樂安眠茶劑用100 mL開水浸泡所得色譜圖各峰分離度較好，故選定該方法為樣品的制備方法。

3.3.2樣品測定條件的選擇 通過考察可得指紋圖譜測定中的方法對本項實驗同樣適用。綜上所述，通過對10批樣品水溶性成分進行相似度計算，數值為0.993～0.997。同時斯皮諾素和腺苷的含量均一穩定，表明建立的樂安眠茶指紋圖譜方法與含量測定方法有良好的分析評價能力，具有簡便、科學、可靠等明顯優勢，可用于該茶劑的質量控制及調節泡茶時間。

參考文獻：

[1] 鐘贛生.中藥學[M].9版.北京:中國中醫藥出版社，2012:335-408.

[2] 郭勝民，范曉雯，何建偉.酸棗仁總黃酮的中樞抑制作用[J].中藥材，1998，21(11):578-579.

[3] 李陸，劉桂友，劉婧姝，等.基于均勻設計法對酸棗仁鎮靜催眠有效組分的配伍研究[J].中草藥，2011，42(7):1374-1377.

[4] 王光亞．保健食品功效成分檢測方法[M]．北京:中國輕工業出版社，2002:143.

[5] 李敏，張建軍.腺苷及其受體與睡眠調節[J].中華臨床醫師雜志:電子版，2012，6(21):6868-6870.

[6] 張飛燕，李晶晶，周瑩，等.安神類中藥及其有效成分對神經遞質鎮靜催眠機制的研究進展[J].中國中藥雜志，2016，41(23):4320-4327.

[7] 李陸，劉婧姝，胡占嵩，等.酸棗仁合歡方質量標準的研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(2):364-365.

[8] 徐奇超，崔慧芳.HPLC法測定痔速寧片中蘆丁與沒食子酸的含量[J].西北藥學雜志，2016，31(1):29-31.

[9] 陳亞麗，洪妍，李繼平，等.HPLC法測定冬蟲夏草中核苷類成分的含量[J].西北藥學雜志，2017，32(4):403-406.

[10]饒偉文，肖聰，鐘名誠.龍眼肉藥材質量標準研究[J].中國藥事，2010，24(8)，792-794.

[11]王和平，王建明，王冬妮.酸棗仁飲片及其炮制品皂苷類成分的指紋圖譜研究[J].中國藥學雜志，2006，41(3):173-175.

[12]國家藥典委員會.中國藥典:2015年版:一部[S].北京:中國醫藥科技出版社，2015:335-336.

[13]章臣桂，金兆祥，高軍，等.超微粉碎與普通粉碎制備的參附強心丸的溶出度的研究[J].中草藥，2005，36(8):1170-1172.

[14]王冰，李寧，董婷霞，等.冬蟲夏草中核苷類成分含量測定及HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2015，38(5):952-956.

[15]祝洪艷，張力娜，唐姍，等.HPLC法測定3個產地酸棗仁中斯皮諾素和酸棗仁皂苷A、B的含量[J].藥物分析雜志，2015，35(12):2099-2104.

[16]岳顯可，曹崗，吳瑤，等.HPLC 法測定猴頭菇核苷類成分腺苷的含量[J].實用藥物與臨床，2015，18(4):432-436.

[17]解軍波，劉艷，張彥青，等.HPLC法測定酸棗仁黃酮片中斯皮諾素[J].中草藥，2010，41(10):1653-1655.

[18]黃炳雄，李建光，王曉容，等.18個龍眼品種果肉中核苷物質的HPLC定量測定[J].廣東農業科學，2008，(3):67-69.

[19]肖維強，賴志勇，戴宏芬，等.龍眼肉中9種核苷類成分的高效液相色譜分析[J].華中農業大學學報，2007，26(5):722-726.

[20]常廣璐，李國輝，李天祥.天津產與市售野生酸棗仁的質量比較研究[J].中草藥，2015，46(5):751-755.