HILIC-HPLC雙波長法測定山藥中尿囊素和腺苷的含量

朱群英，張亞鋒，蘇超男，謝錦艷

(1.陜西省藥品技術審核查驗中心，西安 710065；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；3.煙臺大學，煙臺 264005)

山藥是健脾補氣的良藥，是傳統的保健食品，臨床上常與胃腸飲同用治療脾胃虛弱、食少體倦和泄瀉等癥。山藥中含有鎂、鈉、鉀等多種對人體有益的微量元素，淀粉、蛋白質和游離氨基酸等營養成分以及多糖(包括黏液質及糖蛋白)、尿囊素、山藥素和腺苷等[1-7]。其中尿囊素不僅有滋潤皮膚的作用，還具有局麻和促進皮膚傷口愈合的功能[8-10]；腺苷具有舒張血管、抗心律失常和保護心肌的作用。

尿囊素和腺苷極性很大，在反相色譜柱上保留時間很短，易與極性化合物同時洗脫出色譜柱，導致分離效果不佳[11-12]。親水性高效液相色譜采用強極性固定相，結合高比例有機相和低比例水相組成的流動相對高極性化合物實現有效分離，對于強極性化合物具有很好的保留和高分離選擇性，對中藥復雜組分中強極性化合物的分析有較大優勢[13-19]。本文采用親水性高效液相色譜對尿囊素和腺苷實現同時分離與測定，建立山藥中尿囊素和腺苷的質量分析方法，該方法簡單、靈敏、準確。本方法可為含山藥藥材、飲片及其制劑質量控制標準的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型液相色譜儀配置二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；KQ-300VDB雙頻數控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E萬分之一電子天平、MS105十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2試藥 尿囊素對照品(批號1501-200001)、腺苷對照品(批號110879-200202)，均購自中國食品藥品檢定研究院。10批山藥飲片均購自本市藥店，經西安市食品藥品檢驗所謝志民主任中藥師鑒定為山藥Rhizomadioscoreae，質量符合《中國藥典》2015年版一部要求。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱為Waters XBridge Amide (250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相：乙腈-水(90∶10)；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；雙波長檢測：224和260 nm；理論塔板數按照尿囊素峰計算不低于7 000，各色譜峰之間的分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對照品(224 nm)；B.對照品(260 nm)；C.樣品(224 nm)；D.樣品(260 nm)；1.腺苷；2.尿囊素。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (224 nm)；B.reference substance (260 nm)；C.sample (224 nm)； D.sample (260 nm)；1.adenosine；2.allantoin.

2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒質量的尿囊素對照品和腺苷對照品10和6 mg，置于25 mL量瓶中，加入體積分數為90%的乙腈溶解，定容，分別制得含尿囊素和腺苷質量濃度為0.4和 0.24 mg·mL-1的對照品儲備溶液。分別精密量取尿囊素儲備溶液和腺苷儲備溶液20和5 mL，混勻，制備尿囊素和腺苷的質量濃度分別為320和48 μg·mL-1的混合對照品溶液。不同質量濃度的對照品標準曲線工作溶液由體積分數為90%的乙腈按倍數逐級稀釋得到。

2.3供試品溶液的制備 取山藥飲片粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為90%的乙腈10 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻至室溫，加入體積分數為90%的乙腈補足減失的質量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4線性關系考察 精密量取2.2項下制備的2種對照品儲備液適量，用體積分數為90%的乙腈分別稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。按照2.1項下色譜條件依次進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線。

尿囊素的標準曲線:y=4.760 2x+44.629，r=0.999 3，質量濃度在20.12～319.36 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

腺苷的標準曲線：y=69.181x+130.05，r=0.999 4，質量濃度在3.09～49.12 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗 取標準曲線工作溶液，其中尿囊素和腺苷的質量濃度分別為67.07和10.31 μg·mL-1，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，測定尿囊素和腺苷的峰面積和保留時間，分別計算其RSD值，結果尿囊素峰面積和保留時間的RSD值分別為0.88%和0.15%，腺苷的峰面積和保留時間的RSD值分別為1.09%和0.15%，結果表明，儀器精密度良好。

2.6穩定性實驗 取4號樣品的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，16和24 h進樣，按照2.1項下色譜條件進樣，測定尿囊素和腺苷的峰面積，結果二者色譜峰面積的RSD值分別為1.08%和0.99%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7重復性實驗 取4號樣品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，平行6份，按照2.1項下色譜條件測定尿囊素和腺苷的峰面積，計算尿囊素和腺苷含量的RSD值分別為2.35%和2.56%，結果表明，該方法重復性良好。

2.8加樣回收率 實驗取4號樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入對照品溶液適量，按照2.3項下方法制備供試品溶液，平行6份，進樣分析，計算尿囊素和腺苷的加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果

2.9樣品的測定 取10個不同產地山藥飲片按照2.3項下方法制備供試品溶液，測定尿囊素和腺苷的峰面積，根據回歸方程計算各樣品中尿囊素和腺苷的質量分數，結果見表2。

表2樣品中尿囊素和腺苷的含量

Tab.2 The contents of allantoin and adenosine in samples

樣品尿囊素含量/mg·g-1腺苷含量/mg·g-112．00．94024．20．12032．10．09046．20．22051．70．08561．20．07771．40．08583．00．08192．20．066103．50．130

3 討論

3.1檢測波長的確定 尿囊素和腺苷分別在224和 260 nm波長處有最大吸收，尿囊素在260 nm處不出峰，腺苷在224 nm處響應較小，為了提高檢測的靈敏度，采用雙波長通道進行測定[20-21]。最終將尿囊素和腺苷的波長分別設定為224和260 nm。

3.2樣品提取方法的選擇 分別考察不同濃度的甲醇和乙腈作為提取溶劑，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)不同時間，考察對提取效率的影響。結果表明，以體積分數為90%的乙腈作為提取溶劑，超聲處理30 min為最佳提取方案。

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