山羊BST-2基因的表達及其亞細胞定位

張 莉，劉 騰，繆秋紅，唐井玉，朱 杰，董丹丹，陳宗艷，王桂軍，劉光清，*

(1.安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036； 2.中國農業科學院 上海獸醫研究所，上海200241)

天然免疫是機體與生俱來的對病原微生物的天然抵抗力，在天然免疫中存在著由宿主細胞產生并能抑制或干擾病毒生命活動的因子，這些因子被稱為天然免疫限制因子。目前，已被發現的天然免疫限制因子有APOBEC3、TRIM5α、SAMHD1、MOV10和BST-2(bone marrow stromal cell antigen 2)。其中，BST-2是宿主細胞中最關鍵的防御因子之一，它能夠抑制不同的囊膜病毒從宿主細胞上的釋放及傳播[1]。

BST-2又被稱為CD317、HM1.24、Tetherin，最早發現于終末分化的B細胞表面，在腫瘤細胞、骨髓基質細胞、單核巨噬細胞、樹突狀漿細胞中都有表達。2008年，研究人員首次證明BST-2的抗病毒活性，BST-2能夠抑制HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)病毒粒子的釋放[2]。隨后，研究發現，BST-2對其他一些囊膜病毒也存在一定的限制作用，這其中包括埃博拉病毒[3]、馬爾堡病毒[4]、甲型流感病毒[5-7]、仙臺病毒[8-9]、拉沙熱病毒[10]、丙型肝炎病毒[11]等。

目前，對BST-2的研究主要集中在靈長類動物上，而對羊源BST-2的研究較少。已有研究證實，綿羊BST-2對囊膜病毒出芽存在限制作用，因此推測山羊BST-2也有此作用。本研究對山羊BST-2基因進行了克隆，并利用原核表達系統成功表達并純化了羊源BST-2蛋白，在此基礎上探討了BST-2蛋白在Vero細胞上的亞細胞定位情況。本研究對進一步研究山羊BST-2蛋白的生物學功能及其對羊源囊膜病毒的抗病毒功能提供了一定基礎材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、SolutionⅠ購自TaKaRa公司。Trans2k plusⅡDNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術有限公司。去內毒素質粒中提試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司。限制性內切酶HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ均購自于NEB公司。脂質體轉染試劑Lipfectamine 2000購自Invitrogen公司。DMEM、胎牛血清、PBS均購自于Hyclone公司。Opti-MEM購自Gibco公司。抗Flag標簽小鼠單克隆抗體、抗GST標簽鼠源單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG、FITC標記的山羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司。ECL顯色試劑盒購自賽默飛公司。

1.2 細胞及質粒

E.coliTrans 5α、E.coliBL21(DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。Vero細胞系、p3×Flag-CMV-14、pGEX-4T-1、pUC-BST-2質粒均由筆者所在實驗室保存。

1.3 重組質粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2的構建

根據GenBank中的預測山羊BST-2基因CDS區序列(XM_018051380.1)，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計2對擴增BST-2基因的特異性引物，預期擴增片段大小為495 bp。引物序列如下：BST-2-Flag-F，5’-CCCAAGCTTATGATGGACAAATTGGAAGGATCT-3’(下劃線處為HindⅢ酶切位點)；BST-2-Flag-R，5’-GCTCTAGATTTCTTCAGACACTTGCGGGT-3’(下劃線處為XbaⅠ酶切位點)； BST-2-GST-F，5’-CGCGGATCCATGATGGACAAATTG GAAGGA-3’(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)；BST-2-GST-R，5’-CCGGAATTCATTTCTTCAGACACTTGCG-3’(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)。引物由上海杰李生物技術有限公司合成。

以pUC-BST-2重組質粒為模板，進行目的基因的擴增。利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ、HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，然后分別與用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的載體pGEX-4T-1及HindⅢ和XbaⅠ雙酶切的載體p3×Flag-CMV-14進行連接。連接產物轉化E.coliTrans 5α感受態細胞，37 ℃過夜培養后挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，鑒定正確提取重組質粒分別進行酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組質粒送至上海華津生物技術有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白的表達及純化

將重組質粒pGEX-BST-2轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞，挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養。待D600達到0.6～0.8后，加入1 mmol·L-1IPTG于16 ℃進行誘導表達。確認目的蛋白表達后，再進行蛋白的大量誘導表達，4 ℃離心收集菌體，經過溶菌酶、反復凍融、超聲波處理后，離心獲得上清，按照GST-Sefinose resin GST試劑盒說明書進行目的蛋白的純化。

1.5 Western blot鑒定重組蛋白

重組蛋白BST-2經SDS-PAGE電泳后，半干法轉印至NC膜上，使用含5%脫脂乳的TBST 4 ℃封閉過夜。加入1∶1 000稀釋的抗GST標簽的鼠源單克隆抗體4 ℃孵育過夜。清洗后加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，使用ECL顯色試劑盒顯色。

1.6 Vero細胞的轉染

采用含有10% FBS的DMEM培養Vero細胞，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。當細胞達到80%～90%融合時，在無血清條件下，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉染，同時設置陰性對照組。轉染24 h后，進行間接免疫熒光試驗，激光共聚焦顯微鏡下觀察BST-2蛋白的表達。轉染24 h后，進行Western blot鑒定BST-2的表達。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2的鑒定

PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增片段大小約在495 bp(圖1)，與預期大小一致。重組質粒pGEX-BST-2、p3×Flag-BST-2分別經BamHⅠ和EcoRⅠ及HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，得到與預期大小一致的載體片段及目的基因片段。測序結果表明，目的基因BST-2已被插入pGEX-4T-1和p3×Flag-CMV-14質粒中。

2.2 重組蛋白的表達

將重組質粒pGEX-BST-2轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞，經1 mmol·L-1IPTG于16 ℃誘導表達。SDS-PAGE分析結果，誘導后出現分子質量約為42 ku的特異性蛋白，與預期大小一致(圖2)。未誘導的空載體和重組表達載體的菌株未表達目的條帶。本研究中原核表達的重組BST-2蛋白含有GST標簽，使用抗GST標簽的特異性抗體對目的蛋白進行Western blot鑒定，發現目的蛋白主要在表達菌上清(圖3)。

2.3 Western blot鑒定真核表達BST-2蛋白

真核表達質粒p3×Flag-BST-2轉染Vero細胞24 h后，提取細胞總蛋白，Western blot鑒定BST-2蛋白的表達。本研究中真核表達重組蛋白含有Flag標簽，使用抗Flag的鼠源單克隆抗體作為一抗，Western blot結果顯示，融合蛋白BST-2已成功表達，大小約為21 ku，與預期目的蛋白大小一致。

M，蛋白分子質量標準；1，pGEX-BST-2未經IPTG誘導；2～6，pGEX-BST-2在16、20、24、28、32 h內誘導表達產物；7，空載體未經誘導；8，空載體誘導；9，純化的重組蛋白。M，Protein molecular weight marker; 1，Before induced pGEX-BST-2; 2-6，The plasmid pGEX-BST-2 induced in 16，20，24，28，32 h; 7，pGEX-4T-1 without induction; 8，pGEX-4T-1induced with IPTG; 9，Purified recombinant protein.圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of recombinant protein by SDS-PAGE

M，蛋白分子質量標準；1，pGEX-BST-2誘導上清；2，pGEX-BST-2誘導沉淀。M，Protein molecular weight marker; 1，Supernatant of induced pGEX-BST-2; 2，Sediment of induced pGEX-BST-2.圖3 Western blot鑒定原核表達BST-2蛋白Fig.3 Identification of the prokaryotic expression BST-2 protein by Western blot

2.4 BST-2蛋白的亞細胞定位

真核表達質粒p3×Flag-BST-2轉染Vero細胞24 h后進行間接免疫熒光試驗(IFA)，激光共聚焦顯微鏡下觀察BST-2蛋白的亞細胞定位情況。IFA結果顯示，轉染的重組質粒p3×Flag-BST-2在Vero細胞中，綠色熒光主要在細胞膜上，細胞質內也有綠色熒光，而細胞核中沒有綠色熒光顯現，陰性對照組未見綠色熒光。結果表明，BST-2蛋白主要在Vero細胞膜表達。

M，蛋白分子質量標準；1，真核表達BST-2蛋白。M，Protein molecular weight marker; 1，The eukaryotic expression BST-2 protein.圖4 Western blot鑒定真核表達蛋白Fig.4 Identification of the eukaryotic expression BST-2 protein by Western blot

A，轉染p3×Flag-BST-2的Vero細胞(40×)；B，陰性對照(40×)。A，Vero cells transfected with p3×Flag-BST-2(40×);B，Negative control(40×).圖5 BST-2蛋白在Vero細胞中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of BST-2 protein in Vero cells

3 討論

BST-2是一種能夠被Ⅰ型干擾素誘導表達的跨膜蛋白，包含4個區域，分別是N端胞質尾區(CT)、跨膜區(TM)、胞外螺旋區和C端糖基磷脂酰肌醇錨定位點(GPI)。BST-2的跨膜區和GPI形成了其特殊的拓撲結構，這與它的抗病毒活性密切相關。BST-2能夠抑制多種囊膜病毒的出芽及釋放，同時也發現了一些病毒粒子具有拮抗BST-2功能的蛋白，例如HIV-1的Vpu蛋白能通過不同的策略拮抗BST-2的抗病毒活性[2]，SIV的Nef蛋白下調細胞表面的BST-2表達量來發揮拮抗作用[12]，EIAV的Env蛋白能夠拮抗馬BST-2的抗病毒活性且呈現種屬特異性[13]。

本研究克隆了羊源BST-2基因，并成功用原核表達系統表達了融合GST標簽的BST-2蛋白。此外，將含有BST-2基因的真核表達載體p3×Flag-BST-2轉染Vero細胞，對其在細胞中的表達定位進行了初步分析，結果顯示，該蛋白主要表達于細胞膜上，這可能與其具有跨膜蛋白的結構特征有關，這也決定了BST-2具有在細胞膜上限制病毒釋放的生物學功能。雖然大量研究表明，BST-2能夠發揮抗病毒功能，但非靈長類動物BST-2的抗病毒活性以及病毒拮抗BST-2研究較少，本研究獲得了原核表達的BST-2蛋白，為制備抗BST-2的多克隆抗體提供了前期準備，成功構建真核表達BST-2蛋白的載體能研究其與羊源囊膜病毒各個蛋白的相互作用，這些都為深入探究山羊BST-2抗病毒機制奠定了基礎。

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