鳳頭白鴨鳳頭性狀相關候選基因的表達分析

張 揚，姚文成，王 彬，盧立志，王兆山，徐 琪，常國斌，陳國宏，*

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009； 2.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021； 3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

據《事物紺珠》記載，400年前明代飼養有“頂有高毛、白毛、烏骨”的鳳頭白羽鴨[1]。本課題組經過選育，培育出3 000只具有典型鳳頭性狀的鳳頭白鴨(暫定名)群體[2]。該群體鴨頭部后方的皮膚有一突出的隆起，具有鮮明的觀賞特征，可作為動物園、水景濕地公園等觀賞品種[3]。雖然鳳頭性狀現已得到一定的利用，但其遺傳規律、形成原因以及調控機制尚未闡明。本研究選取了可能與鳳頭白鴨鳳頭性狀相關的基因作為候選因果基因，對這些基因在2種鴨內臟和皮膚等組織中的表達量進行對比分析，尋找其差異，以期為揭示鴨鳳頭表型的產生和尋找其致因突變位點提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取10周齡鳳頭白鴨、連城白鴨各4只，頸部放血后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、背部皮膚、頭部皮膚、鳳頭下皮膚、鳳頭顱內脂肪體等組織樣品，貯存在-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 引物設計

根據NCBI網站GenBank收集的鴨Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2、GAPDH基因序列，利用Primer Blast設計引物，由生工生物工程公司(上海)進行合成。引物序列見表1。

1.3 基因的PCR擴增

采用Trizol研磨法提取2個群體共計8個樣品的總RNA，自然干燥后溶于甲酰胺中，-70 ℃保存備用。反轉錄體系如下：1 μg總RNA樣品，1 μL隨機引物，4 μL 25 mmol·L-1MgCl2，2 μL 10×RT緩沖液，2 μL dNTP，0.5 μL RNA酶抑制劑，1 μL反轉錄酶，加入RNase-free H2O至20 μL。反轉錄程序參照北京天根生物科技有限公司的逆轉錄試劑盒進行，42 ℃孵育15 min后立即95 ℃孵育5 min，獲得的cDNA -20 ℃保存備用。

使用特異性引物，以cDNA為模板，利用PCR進行擴增。各組織候選基因及內參基因重復擴增3次，采用2-△△ct法對數據進行分析。

表1 相關基因擴增引物Table 1 Primers for related genes

2 結果與分析

2.1 Hoxc8基因的組織表達分析

Hoxc8基因在2種鴨心臟(X)、肝臟(G)、脾臟(P)、肺臟(F)、腎臟(S)、大腦(DN)、小腦(XN)、背部皮膚(BP)、頭部皮膚(TP)、鳳頭下皮膚(FP)、顱內脂肪體(ZF)中的表達情況見圖1。研究發現，Hoxc8 2種鴨在大腦、小腦和腎臟組織中有少量表達，并且在背部皮膚組織中表達最高，顯著高于其他組織(P<0.05)。Hoxc8在鳳頭白鴨特有組織(鳳頭下皮膚、顱內脂肪體)中呈現為異常高表達，在連城白鴨頭部皮膚(鳳頭鴨鳳頭下皮膚對應部位)中表達量極低。

**表示不同品種間差異顯著(P<0.01)。**indicated significant difference for that indicator at P<0.01.圖1 Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2基因的相對組織表達Fig.1 Relative expression of Hoxc8，EphB2，EphA2，EphA3 genes in tissues

2.2 Eph基因家族的組織表達分析

EphB2、EphA2、EphA3在2種鴨各組織的相對表達見圖1。由圖可見，EphB2在2種鴨各組織中存在明顯的表達差異性。其中，在2種鴨都采集的組織中，大腦和小腦組織中EphB2的表達量最高；同時，EphB2在顱內脂肪體組織(鳳頭白鴨特有)中，表現為異常的高表達。EphA2在2種鴨的各組織中也均表現為不同程度的表達。其中，在肺、背部皮膚、頭部皮膚等組織中表達較高。與EphB2類似，EphA2在顱內脂肪體組織中，表現為異常的高表達。而在相鄰的大腦和小腦組織中，EphA2表現出低表達。EphA3在2種鴨的各組織中表現為明顯的異位表達規律，其中，EphA3在肺、大腦、小腦等共有的組織中表達較高，在大腦表達最高，顯著高于其他組織。EphA3與EphB2、EphA2一樣在顱內脂肪體組織中呈現出異常的高表達。

3 討論

前人通過GWAS分析的方法[4]，將雞鳳頭性狀決定基因定位在Hox連鎖群上，隨后Wang等[5]進一步的證實Hoxc8是Hox連鎖群上唯一一個和雞鳳頭性狀直接相關的基因。雞的Hoxc8基因在各個組織均明顯的表現為異位表達，其中腎臟組織和背部皮膚的表達量顯著高于其他組織，并且在鳳頭下皮膚組織中呈中高度表達。本研究發現，Hoxc8基因表現為組織特異性表達，并且在鳳頭鴨背部皮膚、鳳頭下皮膚中高表達，驗證了將Hoxc8作為鳳頭性狀因果候選基因的可能。早期研究發現，鴨鳳頭性狀的遺傳規律不符合孟德爾顯性和隱形性狀遺傳規律，而更可能像受到多基因控制的一個數量性狀。在鳳頭白鴨特有組織顱內脂肪體中，Hoxc8基因的高表達顯示，鳳頭的頂心毛表觀性狀和顱內脂肪體的發生可能存在一定的連鎖性。

Eph作為受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族的一個最大的分支，現已知它包含16個成員，其配體命名為Ephrin[6]。根據配體結構及相結合能力，可將Eph受體分成A(10個)、B(6個)亞家族：EphA(EphA1-EphA10)和EphB(EphB1-EphB6)。已有研究表明，在動物神經發育的軸突導向中，Eph發揮了重要作用，并且在組織和細胞之間調控信息的傳遞。在神經系統之外，如在免疫系統、骨骼、內皮細胞、腫瘤的發展和轉移中，Eph和Ephrin也發揮了相關作用[7]，其中在腦腫瘤中，大量研究證實EphA2、EphA3、EphB2、EphB4及其它們相應的配體均表現為高表達[8-9]。

相對于2種鴨的共有組織，在鳳頭白鴨特有組織顱內脂肪體中，3個候選基因(EphA2、EphA3、EphB2)均表現為較高的相對表達量，與該家族基因在鴿皮膚組織表達較為相似[10]，這說明EphB2、EphA2、EphA3等Eph基因可能與鳳頭白鴨顱內脂肪的形成有關。這3個基因中，尤其是EphA2在顱內脂肪體的表達量相對于臨近的組織大腦、小腦表達量很高，這說明EphA2極有可能和鴿上的機制相似，與鴨鳳頭性狀的形成有密切的聯系。90%的鳳頭白鴨個體的顱內都存在脂肪體，并且有極少數個體表現為運動共濟失調，可能由于顱內脂肪體組織的生成使得小腦、嗅球等組織被擠壓而體積較小[11]，不能正常生長和發育，對機體的運動產生了影響。

鴨鳳頭性狀如此特殊并且是可遺傳的，但其致因突變位點還未被準確定位，本研究分析了與鳳頭性狀形成相關的4個候選基因的組織表達，為尋找鴨鳳頭性狀的形成機制提供了數據參考。

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