丁葵草提取物對(duì)小鼠急性炎癥抑制作用的研究

陳秀英，張宇晨，徐向坤，馮雪建

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，國(guó)家藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心，藥物關(guān)鍵制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450001)

炎癥是腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌等眾多疾病的病變基礎(chǔ)[1-5]，臨床上多用非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行治療，雖然效果良好，但不良反應(yīng)多。很多傳統(tǒng)中藥具有良好的抗炎效果，且副作用較少，從天然藥物中開發(fā)抗炎藥物逐步受到人們的重視。

丁葵草別名人字草、丁貴草、二葉人字草等，為豆科丁葵草屬丁葵草[Zorniadiphylla(L.) Pers]的干燥全草。丁葵草主要有效成分包含黃酮苷、異黃酮、酚類、氨基酸等，具有清熱解毒、祛淤、利尿和抗腫瘤作用。臨床可用于感冒、痢疾、黃疸、咽喉炎、乳腺炎等[6-7]，目前未見丁葵草對(duì)急性炎癥作用的報(bào)道。本文旨在探討丁葵草對(duì)小鼠急性炎癥發(fā)生發(fā)展的作用，為研究開發(fā)新的抗炎藥物和丁葵草的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司)；電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；全自動(dòng)脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、切片機(jī)、染色封片一體工作站、圖像采集系統(tǒng)(均購(gòu)自德國(guó)徠卡有限公司)。伊文思藍(lán)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)A1309044)；復(fù)方醋酸地塞米松凝膠(江西吉安三力制藥有限公司，批號(hào)151006)；醋酸地塞米松片(福州海王福藥制藥有限公司，批號(hào)1702220)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)41003100004497。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

丁葵草提取物的制備[8-9]：將丁葵草全草50 ℃干燥，粉碎，過50目篩，稱重，加12倍(m/V)量的40%乙醇，90 ℃水浴回流提取1 h，重復(fù)3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至含原生藥1 g·mL-1，用去離子水另配成每mL含0.33 g和0.11 g原生藥的藥劑，分別標(biāo)記為丁葵草高、中和低劑量提取液，置4 ℃冰箱備用。

1.4 丁葵草對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

取30只小鼠，隨機(jī)分成5組：動(dòng)物模型組，陽(yáng)性藥物(地塞米松)組，丁葵草高、中、低劑量組。每組6只，雌雄各半。本試驗(yàn)采用灌胃給藥，灌胃體積0.2 mL·10 g-1，陽(yáng)性藥物以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混懸，用量1.17 mg·kg-1；丁葵草高、中、低劑量組分別給予上述制備的不同劑量提取液；模型組灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)5 d，每天1次。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水采食。采用腹腔染料滲出法，參照文獻(xiàn)[10]方法于末次給藥30 min后每只動(dòng)物尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1 mL·10 g-1，隨即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，20 min后頸椎脫臼法處死小鼠。用5 mL生理鹽水沖洗腹腔，洗液700g離心5 min，取上清，酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液在590 nm波長(zhǎng)處吸收值(D)，以此表示色素滲出率，并計(jì)算毛細(xì)血管通透性的抑制率。

1.5 丁葵草對(duì)二甲苯致小鼠耳片腫脹的抑制作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組同上。參照文獻(xiàn)[11]方法用微量進(jìn)樣器吸取20 μL二甲苯，均勻涂抹在各組小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)，左耳涂以等體積蒸餾水作為對(duì)照。30 min后給藥，除模型組動(dòng)物右耳涂抹生理鹽水外，其余各組動(dòng)物右耳均勻涂抹相應(yīng)藥物，各組動(dòng)物左耳均涂抹等體積生理鹽水，陽(yáng)性藥物選擇復(fù)方醋酸地塞米松凝膠。用藥1 h后頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳郭基線剪下雙耳，分別在左右耳相同部位用9 mm打孔器打下耳片，立即稱重，以左右兩耳片質(zhì)量差值表示腫脹度，并與模型組比較計(jì)算耳片腫脹抑制率。

1.6 丁葵草對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的抑制作用

動(dòng)物分組和用藥同上。參照文獻(xiàn)[12]方法于最后一次給藥30 min后，將30 μL 1%(m/V)角叉菜膠注射于小鼠左足跖皮下，右側(cè)注射等體積生理鹽水作為對(duì)照。用藥4 h后處死小鼠，沿踝關(guān)節(jié)下緣剪下左右兩足，準(zhǔn)確稱量，計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率。

將足趾沿正中矢狀面切開，一部分組織稱重，加9倍量(m/V)生理鹽水，剪碎，室溫浸泡2 h，1 400g離心5 min，取上清液200 μL加入2 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液，50 ℃水浴20 min，吸取200 μL加于96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)278 nm波長(zhǎng)處吸光度(D)值，用D值代表炎癥部位PGE2的含量[13]。另一部分足用4%甲醛溶液固定，HE染色，用徠卡顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)對(duì)足趾切片進(jìn)行觀察及采集，觀察組織病理變化。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA法)，組間用LSD法兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁葵草對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

與動(dòng)物模型組相比，地塞米松組和丁葵草高劑量組在急性炎癥發(fā)生時(shí)能極顯著地抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加(P<0.01)，丁葵草中劑量組亦可使小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性顯著降低(P<0.05)，丁葵草低劑量組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性雖有所下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 丁葵草對(duì)小鼠耳片腫脹的抑制作用

與模型組相比，丁葵草高劑量組和地塞米松組均可顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹的發(fā)生率(P<0.01)，且二者對(duì)小鼠耳片腫脹的抑制效果相當(dāng)。與模型組相比，丁葵草中劑量組亦可顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹的發(fā)生(P<0.01)，但腫脹抑制率較高劑量組和地塞米松組差。丁葵草低劑量組未見對(duì)小鼠耳片腫脹有明顯抑制作用。結(jié)果顯示，隨丁葵草提取液濃度的下降，其對(duì)耳片腫脹率抑制效果降低，呈劑量依賴性，結(jié)果見表2。

2.3 丁葵草對(duì)小鼠足腫脹的抑制作用

2.3.1 小鼠足腫脹的測(cè)定與分析

與模型組比較，地塞米松組和丁葵草高、中劑量組對(duì)小鼠足腫脹有極顯著的抑制作用(P<0.01)；丁葵草低劑量組對(duì)足腫脹無顯著性抑制作用。該結(jié)果與其對(duì)足炎癥部分PGE2滲出抑制結(jié)果(以D278值表示)相符，結(jié)果見表3。

2.3.2 小鼠足腫脹部位病理學(xué)改變

和正常足趾(圖1-A)相比，模型組小鼠足趾血管充血，皮下結(jié)締組織及肌間水腫，且有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為急性化膿性炎癥(圖1-B)。與動(dòng)物模型組相比，地塞米松及丁葵草高劑量組炎性細(xì)胞滲出明顯變少，水腫減輕(圖1-C，圖1-D)。丁葵草中、低劑量組主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞滲出減少，水腫差異不明顯，炎癥程度明顯有所緩解，見圖1。

表1 丁葵草對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響Table 1 Effects of Zornia diphylla (L.) Pers on peritoneal capillary permeability in mice induced by acetic acid

與動(dòng)物模型組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；“—”指沒有數(shù)據(jù)。下同。
In comparison with the model group，* represents significant difference (P<0.05)，** represents extremely significant difference (P<0.01), “—” indicates no data available. The same as below.

表2 丁葵草對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹率的影響Table 2 Effects of Zornia diphylla (L.) Pers on ear swelling of mice induced by xylene

表3 丁葵草提物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響Table 3 Effects of Zornia diphylla(L.) Pers on paw swelling of mice induced by carrageenan

A，正常足；B，動(dòng)物模型組；C，陽(yáng)性藥物對(duì)照組；D，丁葵草高劑量組；E，丁葵草中劑量組；F，丁葵草低劑量組。HE染色，100 ×。A，Normal foot; B，Animal model group; C，Dexamethasone group; D，Zornia diphylla (L.) Pers high dose group; E，Zornia diphylla (L.) Pers middle dose group; F，Zornia diphylla (L.) Pers low dose group. HE staining，100 ×.圖1 各組小鼠足HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of paw in each group

3 討論

炎癥是具有血液循環(huán)的活體組織對(duì)損傷因子所產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，是臨床常見的病理過程。炎癥發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是炎癥部位的血管反應(yīng)，損傷因子可引起炎癥部位毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，通透性增加，中性粒細(xì)胞趨化、游走至炎癥部位，釋放出PGE2等多種炎性介質(zhì)。

丁葵草味甘、性涼，主要有效成分包括黃酮類、酚類、氨基酸類等，臨床主要用于感冒、咽喉炎、乳腺炎等，但單獨(dú)針對(duì)該藥的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典的炎癥模型來研究丁葵草提取物的抗炎作用。

腹腔染料滲出法是研究藥物抗炎作用常用的方法。低濃度醋酸具有強(qiáng)烈的致炎作用，可導(dǎo)致小鼠腹腔組織毛細(xì)血管通透性的增加，可用染料滲出率來表示毛細(xì)血管通透性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射醋酸后小鼠腹腔色素滲出率明顯增加。給予丁葵草提取液和地塞米松后，與模型組相比，給藥組染料(伊文思藍(lán))的滲出率均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(地塞米松和丁葵草高劑量組P<0.01，丁葵草中劑量組P<0.05)，其中丁葵草高劑量組抑制色素滲出率的作用與地塞米松相同，且具有一定劑量依賴性。

二甲苯是常用的化學(xué)致炎物，可誘導(dǎo)組胺、激肽、PGE2等炎性介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致耳片局部充血、水腫、滲出等一系列急性炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，涂抹二甲苯后，小鼠耳郭腫脹明顯。丁葵草提取液高、中劑量組和地塞米松均能顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳郭腫脹炎癥反應(yīng)(P<0.01)，對(duì)腫脹的抑制率具有一定的劑量依賴關(guān)系。丁葵草高劑量組對(duì)耳郭腫脹的抑制作用與地塞米松相同。

角叉菜膠亦是急性炎癥模型的良好致炎劑，給小鼠足內(nèi)注射角叉菜膠可出現(xiàn)局部毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管通透性增加，滲出、水腫等一系列類似于人體急性炎癥的反應(yīng)，并誘導(dǎo)PGE2等一系列炎癥因子的生成[14-17]。PGE2是強(qiáng)效擴(kuò)血管物質(zhì)，并協(xié)同其他活性物質(zhì)參與血管滲漏水腫、疼痛等炎癥反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射角叉菜膠后小鼠足部即開始發(fā)生炎癥并腫脹，丁葵草高劑量和地塞米松組均可顯著抑制角叉菜膠所致的小鼠足腫脹，降低炎癥部位PGE2的含量(P<0.01)。病理結(jié)果顯示，丁葵草提取物可顯著降低炎癥部位的水腫程度和炎性細(xì)胞的滲出，與上述炎癥模型數(shù)據(jù)一致。

綜上，丁葵草提取液對(duì)炎癥的發(fā)生有明顯的抑制作用，且具有一定的劑量依賴性，該作用可能與抑制炎癥部位PGE2的產(chǎn)生有關(guān)，實(shí)驗(yàn)證明丁葵草高劑量組與地塞米松組抗炎效果相近。地塞米松為甾體類抗炎藥，雖然抗炎作用較強(qiáng)，作用廣泛，但不良反應(yīng)較多，給藥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)皮毛光澤度差，體重減輕等癥狀。在給藥過程中，未見丁葵草提取液對(duì)小鼠有明顯毒性作用。故丁葵草提取液在相同藥效時(shí)不良反應(yīng)較低，本試驗(yàn)為尋找安全有效的抗炎藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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