thanatin串聯(lián)抗菌肽原核表達(dá)研究

劉 偉，李清海，劉仁虎

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 放射科，浙江 杭州 310009； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021)

抗菌肽是一類具有抗菌活性的生物短肽，在自然界分布廣泛、種類繁多，但是產(chǎn)量不多[1]。抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性，因而是未來應(yīng)對耐藥性病原菌的希望之星，近年來成為新興醫(yī)藥、植物抗病基因工程、養(yǎng)殖飼料添加劑的研究熱點[2-3]。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽的價格限制了大規(guī)模生產(chǎn)[4]。thanatin是從半翅目昆蟲刺肩蝽(Podisusmaculiventris)的血淋巴中分離的一種高活性抗菌肽，由21個氨基酸組成(GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM)，在11位和18位的半胱氨酸形成二硫鍵[5]。二硫鍵對thanatin的抗菌活性可有可無，并不是必需的[6]。由于該抗菌肽對真菌的殺菌活性高而受到關(guān)注。

利用微生物工程菌對抗菌肽進(jìn)行表達(dá)是低成本獲得抗菌肽的最佳途徑。大腸埃希菌E.coli是目前利用最為廣泛的表達(dá)宿主菌，因為其具有遺傳背景清楚，易于操作，培養(yǎng)成本簡單，生產(chǎn)上應(yīng)用成本低的特點[7]。對于一些含有維持抗菌活性必需的二硫鍵的抗菌肽，可以選擇trxB和gor基因缺失的大腸埃希菌菌株，Novagen公司的Origami B、Origami 2和 Rosetta-gami B菌株具有該特性[8]，另外的方法就是引入信號序列，使目標(biāo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間，形成二硫鍵[9]。由于抗菌肽對宿主具有毒性，不少學(xué)者都嘗試用不同的融合標(biāo)簽來提高抗菌肽的表達(dá)水平和增加蛋白的可溶性[10]。因此本研究通過串聯(lián)表達(dá)抗菌肽單體與MBP蛋白融合表達(dá)，希望能夠提高抗菌肽的表達(dá)效率，同時提高抗菌肽單位效價，為后續(xù)進(jìn)行不同抗菌肽串聯(lián)的表達(dá)提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，為本實驗室保存，表達(dá)載體pCreat-M由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司提供。

1.1.2 酶與試劑

限制內(nèi)切酶、連接酶以及DNA marker購自NEB北京有限公司，6×His Tag Antibody，HRP conjugate購自Invitrogen，Western熒光檢測試劑BeyoECL Plus購自碧云天生物技術(shù)研究所。蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司，IPTG購自Amresco公司，脫脂奶粉購自國內(nèi)伊利集團(tuán)；其他化學(xué)試劑來自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

從抗菌肽數(shù)據(jù)庫中檢索抗菌肽的氨基酸序列，進(jìn)行核苷酸密碼子優(yōu)化，并合成3個串聯(lián)重復(fù)的thanatin基因，該基因由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.2.2 載體的構(gòu)建

將含有3×thanatin基因的克隆載體pUC57，經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切純化回收后，與含有相同酶切過的表達(dá)載體pCreat-M，通過 T4 DNA ligase，20 ℃連接 2 h，轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10，通過抗性篩選和酶切驗證，驗證目的片段是否連接到目的載體。

1.2.3 表達(dá)及優(yōu)化

挑取劃線平板上單克隆接種于含適量抗性的LB培養(yǎng)液的試管中；37 ℃ 220 r·min-1振搖至菌體D600為0.6～0.8；取出1 mL培養(yǎng)物，10 000g室溫離心2 min，棄上清，用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀加入20 μL的5×Loading Buffer；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，在37 ℃ 220 r·min-1振搖4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1 mL培養(yǎng)物，12 000g室溫離心2 min，棄上清，用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀加入20 μL的5×loading buffer。隨后對不同誘導(dǎo)濃度和不同誘導(dǎo)時間進(jìn)行檢測分析，找出最佳表達(dá)條件。最后在此基礎(chǔ)上，對表達(dá)的蛋白進(jìn)行可溶性分析，誘導(dǎo)后的菌液離心2 min，棄上清，用500 μL的緩沖液A(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重懸離心后沉淀，超聲波破碎(Φ3，15%，2 s/8 s，10 min)，上清沉淀分別制樣，通過電泳分析目的蛋白可溶性。

1.2.4 蛋白電泳

加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，95 ℃變性10 min，立即插入冰中待用；將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調(diào)至200 V使樣品通過濃縮膠與分離膠。電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置，結(jié)束電泳。進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-blot檢測

按著上述條件電泳完畢，進(jìn)行半干式電轉(zhuǎn)印凝膠電泳，30 V，45 min結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF，然后用1×PBST洗膜3次，用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫漂洗3次，加入抗體6×His Tag antibody，HRP conjugate(1∶2 000到5% 脫脂奶粉中)，孵育1 h。室溫用1×PBST漂洗5 min，共3次。緩慢加入少量ECL顯色液，能將膜全部覆蓋，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，拍攝。

1.2.6 親和純化與酶切

親和純化：采用最優(yōu)表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，8 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，收集所有菌體。使用緩沖液A(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎(Φ10，15%，2 s/8 s，30 min)。16 000 r·min-1離心10 min，收集上清。在上清中加入2 mL Ni-NTA，混勻后4 ℃孵育1 h。將孵育物加入空柱管，收集流出液。分別以緩沖液B(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)與緩沖液C(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，40 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)清洗填料，收集清洗液。利用緩沖液D(20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1imidazole，pH 8.0)洗脫，收集洗脫液。

酶切：將上一步驟洗脫樣透析至緩沖液A中，取少量透析產(chǎn)物，在其中加入適量的TEV protease，4 ℃反應(yīng)16 h。利用緩沖液A平衡Ni-NTA親和層析柱后，將反應(yīng)產(chǎn)物緩慢加入層析柱，收集流出樣。利用緩沖液A清洗層析柱，收集清洗樣。利用緩沖液D洗脫，收集洗脫樣。將上一步驟酶切后流出樣全部收集至透析袋(3.8 ku截留分子量)，在PEG8000粉末中濃縮，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.7 液相質(zhì)譜分析

蛋白的制備：細(xì)胞培養(yǎng)的上清液混合了4倍體積的冷丙酮，過夜保存在-20 ℃，在20 000g下離心沉淀蛋白。蛋白沉淀用丙酮洗滌3次，并溶解在8 mol·L-1尿素和50 mmol·L-1TEAB(pH 8.0)中，隨后經(jīng)過一系列的TECP還原、碘乙酰胺烷基化、稀釋以及胰蛋白酶消化(1∶100酶蛋白比)，然后將經(jīng)過C18柱脫鹽和真空冷凍離心干燥。肽段分析采用Dionex ultiMate 3000 nano LC系統(tǒng)耦合到Thermo Scientific公司的Flex離子源。柱子型號為PepMap C18柱。樣品通過Q-Exactive Orbitrap HF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

1.2.8 抗菌試驗

取一小塊活化的核盤菌菌絲接種于PDA平板中央，21.5 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，在新長出的菌絲圈外0.5 cm處，用200 μL槍頭印下淺溝(1～2 mm深)，將20 μL相應(yīng)濃度的抗菌肽水溶液加于環(huán)狀溝中，再在21.5 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h，觀察抑菌效果，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆及其表達(dá)載體的成功構(gòu)建

thanatin核苷酸序列由通用公司體外合成。含有該基因的pUC57克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有AP+抗性平板上大腸埃希菌E.coliTOP，挑選單克隆，提取質(zhì)粒，通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切進(jìn)行電泳檢測，如圖1，酶切后基因片段大小符合理論值。后經(jīng)基因測序公司進(jìn)行測序，證明該基因正確地克隆到表達(dá)載體pCreat-M中。

2.2 蛋白表達(dá)檢測及優(yōu)化

將上述構(gòu)建好的表達(dá)抗菌肽的工程菌pCreat-T/E.coliBL21(DE3)進(jìn)行不同時間誘導(dǎo)表達(dá)，如圖2所示，每隔2 h取樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明目的融合蛋白得到了表達(dá)。誘導(dǎo)4 h，目的蛋白表達(dá)量最大，表達(dá)的氨基酸序列理論分子量為52.4 ku，與預(yù)期大小相符，隨后通過Western blot進(jìn)行檢測，目的蛋白表達(dá)進(jìn)一步被證實，如圖3。通過不同溫度，不同誘導(dǎo)物IPTG的濃度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)在37 ℃和15 ℃蛋白均可以表達(dá)，但37 ℃溫度下蛋白的可溶性的表達(dá)量優(yōu)于15 ℃條件下的表達(dá)，且1.0 mmol·L-1濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的可溶性優(yōu)于0.2 mmol·L-1濃度IPTG下的蛋白表達(dá)(圖4)。

Lane M，DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量； Lane 1，構(gòu)建的質(zhì)粒BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的電泳，目標(biāo)片段位于250 bp下方； Lane 2，構(gòu)建的質(zhì)粒電泳。Lane M，DNA standard molecular weight；Lane 1，Electrophoresis analysis of plasmids by the double enzyme digestion; Lane 2，Electorphories analysis of the plasmids.圖1 質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.1 Double enzymes digestion results of recombinant plasmid

Lane M，Protein ladder marker；Lane 1，誘導(dǎo)前；Lane 2-6，每隔2 h不同時間點取樣。Lane M，Protein ladder marker; Lane 1，SDS-PAGE of induced sample; Lane 2-6: SDS-PAGE of induced samples at every 2 hours.圖2 抗菌肽表達(dá)的SDS-PAGE電泳峰分析Fig.2 SDS analysis of protein expression after different periods of E. coli strain

M，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1，樣品。M，Protein marker; Lane 1，Sample.圖3 重組菌pCreat-T/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Western blot鑒定Fig.3 Western blot identification of the induced products of recombinant bacteria pCreat-T/BL21(DE3)

M，Protein marker；Lane 1，未誘導(dǎo)樣品；Lane 2，誘導(dǎo)后樣品；Lane 3，37 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 4，37 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 5，37 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 6，37 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 7，15 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 8，15 ℃ 1.0 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣；Lane 9，15 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后上清樣；Lane 10，15 ℃ 0.2 mmol·L-1 IPTG誘后沉淀樣。M，Protein marker; Lane 1，Uninduced control; Lane 2，Induced sample; Lane 3，Induced supernatant by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 4，Induced precipitated sample by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 5，Induced supernatant by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 6，Induced precipitated sample by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 37 ℃; Lane 7，Induced supernatant by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 8，Induced precipitated sample by 1.0 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 9，Induced supernatant by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃; Lane 10，Induced precipitated sample by 0.2 mmol·L-1 IPTG under 15 ℃.圖4 pCreat-T在E. coli中的可溶性分析Fig.4 Soluble detection of pCreat-T in E. coli

2.3 蛋白的純化與酶切

經(jīng)過對含有20、40和500 mmol·L-1不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)500 mmol·L-1咪唑洗脫液里含有目的蛋白(圖5)。經(jīng)過酶切后流出液全部收集至透析袋(3.8 ku截留分子量)，在PEG8000粉末中濃縮，最終溶解在20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0溶液中，Nanodrop測得最終樣品濃度為0.02 mg·mL-1。樣品經(jīng)過質(zhì)譜檢測，檢測出抗菌肽序列片段(圖6)，表明抗菌肽已成功表達(dá)。根據(jù)該質(zhì)譜特征目標(biāo)多肽鑒定為KPVPIIYCNR，其中C8氨基酸為脲甲基化修飾。該多肽為3×thanatin多聚抗菌肽胰蛋白酶酶解后的主要產(chǎn)物。

2.4 抑菌結(jié)果

將3×thanatin串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物稀釋到不同濃度進(jìn)行體外抑菌試驗，結(jié)果見圖7與對照緩沖液D比較，12～36 ng·μL-1的抗菌肽表達(dá)產(chǎn)物對核盤菌具有微弱的抑菌活性，48 ng·μL-1的抗菌肽原核表達(dá)產(chǎn)物對核盤菌具有顯著的抑菌活性。換算為3×thanatin抗菌肽的當(dāng)量濃度約在6.6 μmol·L-1，而化學(xué)合成的thanatin抗菌肽對核盤菌的抑菌濃度約為64 μmol·L-1，3×thanatin抗菌肽抑菌活性提升了約1個數(shù)量級。

Lane M，Protein marker；Lane 1，破碎后沉淀；Lane 2，破碎后上清；Lane 3，Ni-NTA孵育后流出液；Lane 4，緩沖液B清洗樣；Lane 5，緩沖液C清洗樣；Lane 6，緩沖液D洗脫樣。Lane M，Protein marker; Lane 1，Precipitate of ultrasonic treatment; Lane 2，Supernatant of ultrasonic treatment; Lane 3，Ni-NTA column flow through; Lane 4，Column wash by buffer B; Lane 5，Column wash by buffer C; Lane 6，Column elution by buffer D.圖5 pCreat-T在E. coli表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果Fig.5 Purification result of recombinant pCreat-T in E. coli

3 討論

菌核病(Sclerotiniastem rot)是由核盤菌寄生引起的一種嚴(yán)重的真菌性病害。該病的發(fā)生每年對油菜的產(chǎn)量損失達(dá)到10%～30%[11]。在前期的研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)在64 μmol·L-1濃度下1×thanatin對核盤菌具有明顯的抑制效果，而本研究發(fā)現(xiàn)3×thanatin對核盤菌的抑菌活性提高了約1個數(shù)量級，其中的作用機(jī)制尚不明確，一方面3×thanatin在相同摩爾濃度下質(zhì)量濃度更高，另一方面原核表達(dá)的3×thanatin在半胱氨酸殘基上有脲甲基修飾。除此之外，抗菌肽thanatin對細(xì)菌也有抑制效果，細(xì)胞毒性小，且革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于革蘭氏陽性菌[12]，這些研究發(fā)現(xiàn)都為thanatin在防治菌核病上應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

圖6 洗脫樣的質(zhì)譜鑒定Fig.6 MS spectra of the substance derived from the elution sample

1，對照緩沖液D; 2，原核表達(dá)的抗菌肽12 ng·μL-1; 3，原核表達(dá)的抗菌肽 24 ng·μL-1; 4，原核表達(dá)的抗菌肽36 ng·μL-1; 5，原核表達(dá)的抗菌肽48 ng·μL-1。1，Buffer D as control; 2，The expressed thanatin at 12 ng·μL-1; 3，The expressed thanatin at 24 ng·μL-1; 4，The expressed thanatin at 36 ng·μL-1; 5，The expressed thanatin at 48 ng·μL-1. 圖7 原核表達(dá)的thanatin抗菌肽串聯(lián)體對核盤菌的抑菌效果Fig.7 Inhibition effect of tandem thanatin on Sclerotinia sclerotiorum

在過去幾十年，很多學(xué)者嘗試對不同抗菌肽雜合進(jìn)行表達(dá)以獲得高效抗菌活力和降低細(xì)胞毒性[3,13-16]，如CecropinA和LL-37雜交形成的新抗菌肽展示出很強(qiáng)的抗菌活性，并且對綿羊紅細(xì)胞沒有溶血毒性[15]。在前期，我們對抗菌肽thanatin的不同拷貝數(shù)以及不同蛋白標(biāo)簽進(jìn)行構(gòu)建[17]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過3個拷貝的thanatin和含有sumo標(biāo)簽的蛋白在大腸埃希菌中都沒有成功表達(dá)。只有3個拷貝的thanatin與MBP標(biāo)簽融合表達(dá)才能成功，個中原因并不清楚。總之，本研究對相同多拷貝抗菌肽的成功表達(dá)，為后續(xù)多拷貝基因以及雜合抗菌肽的融合表達(dá)提供了一種策略，同時對提高抗菌肽表達(dá)豐度和擴(kuò)大抗菌肽抗菌譜提供了理論依據(jù)和應(yīng)用價值。

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