基于優(yōu)化顯微定量法的吳茱萸質(zhì)量評(píng)價(jià)△

劉旭穎，王紋嵐，葛朝暉，陳聰慧

(臨沂大學(xué) 藥學(xué)院，山東 臨沂 276000)

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分。中藥成分復(fù)雜，品種繁多，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥品質(zhì)量控制限于對(duì)大部分中藥的定性鑒別和少數(shù)中藥的某一單一化學(xué)成分的定量檢測(cè)，測(cè)量和控制中藥產(chǎn)品中的任何一種成分無法代表它的整體質(zhì)量，可控性和專屬性尚不完善。以化學(xué)藥品質(zhì)量控制方法為模式用于中藥產(chǎn)品不夠精準(zhǔn)、完善。中藥的質(zhì)量控制需要宏觀的、多因素的質(zhì)量控制模式，來適應(yīng)中藥這種基于多成分的協(xié)調(diào)、互補(bǔ)或制約、起著宏觀調(diào)控作用的特點(diǎn)。因此，單純依靠化學(xué)分析手段控制中藥質(zhì)量與中藥的特點(diǎn)是不相符的，中藥質(zhì)量控制需要多種檢測(cè)途徑的協(xié)同應(yīng)用。

顯微定量法是根據(jù)顯微特征的專屬性和穩(wěn)定性，對(duì)中藥某一專屬特征進(jìn)行定量分析，從而鑒定中藥真?zhèn)?、?yōu)劣的方法。中藥顯微定量法要求所研究的中藥應(yīng)具有專屬性、可計(jì)數(shù)性的顯微特征；所用儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便。該法可以作為化學(xué)方法的補(bǔ)充來檢測(cè)中藥質(zhì)量。傳統(tǒng)顯微定量法雖然操作簡(jiǎn)便，對(duì)顯微定量法的具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都沒有經(jīng)過優(yōu)化，在實(shí)踐中并沒有被推廣使用。因此，本研究通過設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到優(yōu)化的顯微定量方法，從而對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

吳茱萸(Euodiae Fructus)為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實(shí)，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉之功效。本品粉末褐色，非腺毛2～6細(xì)胞，長(zhǎng)140～350 μm，壁疣明顯，有的胞腔內(nèi)含棕黃色至棕紅色物[1-2]。吳茱萸粉末中的非腺毛顯微特征明顯，不僅具有生物學(xué)穩(wěn)定的特性，而且數(shù)量眾多，易于觀察計(jì)數(shù)，見圖1。本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的顯微定量方法[3]測(cè)定不同樣品吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值大小；采用高效液相法對(duì)吳茱萸中的指標(biāo)性化學(xué)成分檸檬苦素進(jìn)行含量測(cè)定；用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)值與化學(xué)成分檸檬苦素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在通過測(cè)定不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)值大小，判斷吳茱萸質(zhì)量的優(yōu)劣，為評(píng)價(jià)吳茱萸的質(zhì)量提供一種新的方法。通過本課題的研究，為中藥的質(zhì)量鑒定開辟了新的研究方法，為中藥質(zhì)量檢測(cè)體系進(jìn)行了有益的充實(shí)。

圖1 吳茱萸非腺毛

1 儀器與材料

1.1 儀器

OLYMPUS CX-41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AUX220萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；KQ3200DV超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；JK-APG-100高速萬能粉碎機(jī)(上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

檸檬苦素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z06M8C30368，純度>98%)。水合氯醛、甘油、磷酸、乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為分析純；乙腈、四氫呋喃(天津市康科德科技有限公司)均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水合氯醛試液依照2015年版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)一部附錄配制。

吳茱萸樣品來源于各大藥房及中藥材批發(fā)市場(chǎng)，由于產(chǎn)地、炮制加工、儲(chǔ)存條件等各種因素的不同均會(huì)導(dǎo)致質(zhì)量差異。所有實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)臨沂大學(xué)藥用植物學(xué)教研室王文房教授鑒定為吳茱萸正品，具體來源見表1。

表1 吳茱萸樣品信息

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2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸各樣品水分測(cè)定

按《中國藥典》2015年版通則0832第二法，測(cè)定1～8號(hào)樣品含水量，結(jié)果分別為11.26%、12.53%、13.15%、12.28%、11.82%、13.76%、12.63%、14.57%。

由水分測(cè)定結(jié)果可知，各樣品水分含量均低于15%，符合《中國藥典》要求。其中8號(hào)樣品(來源于臨沂中藥材批發(fā)市場(chǎng))水分含量接近15%，可能是由于中藥材批發(fā)市場(chǎng)的貯存條件等影響，水分含量高于其他藥店樣品。

2.2 顯微定量法條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

針對(duì)可能影響顯微定量法的實(shí)驗(yàn)因素，以均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)顯微特征常數(shù)測(cè)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)選，優(yōu)化顯微定量方法。影響因素主要有樣品質(zhì)量、樣品的粉碎粒度、混懸劑的用量?？紤]到各因素的考察水平有所不同，故本實(shí)驗(yàn)采用3因素6水平均勻設(shè)計(jì)法考察顯微定量法的優(yōu)化條件[4]，吳茱萸中非腺毛顯微定量法的均勻設(shè)計(jì)方案具體見表2。

表2 吳茱萸中非腺毛顯微定量法的均勻設(shè)計(jì)方案U6(63)

取1號(hào)吳茱萸樣品粉碎，分別過80目和100目篩。精密稱定75.0、100.2、125.1、150.1、174.9、200.1 mg共6份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL量瓶中，按表2加入相應(yīng)甘油量，最后用實(shí)驗(yàn)用水合氯醛試液定容。充分搖勻后，精密吸取0.02 mL進(jìn)行顯微裝片，每份樣品溶液平行裝片50張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計(jì)數(shù)。將所得的結(jié)果隨機(jī)分為5組，分別計(jì)算5組平均值的RSD。以每份樣品平均值的RSD為考察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 吳茱萸中非腺毛數(shù)值測(cè)定的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件得出均勻設(shè)計(jì)結(jié)果：Y=13.313-0.021X1-0.057X2，r=0.996；其中Y為RSD(%)；X1為樣品質(zhì)量；X2為粉碎粒度；X3為加入甘油量。從輸出的方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)=186.873，P=0.001，故線性回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果方程：為使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Y值(RSD值)最小，選取X1、X2最大值：200 mg、100目為優(yōu)化條件；X3未進(jìn)入方程，故根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選擇。最終優(yōu)化結(jié)果：樣品稱樣量200 mg，粉碎過100目篩，加入甘油10 mL，Ymin=3.41%，數(shù)據(jù)精密度良好。

2.3 優(yōu)化顯微定量法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取完全過100目篩的1號(hào)樣品粉末3份各200.0 mg，精密稱定，用水合氯醛多次研磨轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入甘油10 mL，最后用水合氯醛定容，充分搖勻后精密吸取0.02 mL樣品液，平行制片50張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計(jì)數(shù)。將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行完全隨機(jī)化分為5組，計(jì)算每組的RSD值，結(jié)果見表4。

表4 吳茱萸中非腺毛數(shù)值測(cè)定的均勻設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

對(duì)優(yōu)化的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，各份樣品的變異系數(shù)均與優(yōu)化條件給出的最小變異系數(shù)Ymin(3.41%)接近，說明由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件給出的優(yōu)化條件是科學(xué)、準(zhǔn)確的。

2.4 吳茱萸各樣品非腺毛顯微特征常數(shù)值測(cè)定

分別精密稱定吳茱萸8種樣品粉末，每種樣品各3份，按照均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化顯微定量法條件，水合氯醛多次水飛，分別定容于25 mL量瓶中，精密吸取20 μL溶液，分別平行裝片50張，觀察非腺毛，計(jì)數(shù)，按公式(1)計(jì)算非腺毛顯微特征常數(shù)值(P)，取平均值，結(jié)果見表5。

P=(X×V)/(V′×m)

(1)

式中：m為樣品質(zhì)量(mg，按干燥品計(jì))；V為定量樣品混懸液總體積(mL)；P為定量樣品顯微特征常數(shù)(個(gè)·mg-1)；V′為蓋玻片下樣品混懸液體積(mL)；X為每片蓋玻片下樣品顯微特征數(shù)。

表5 各吳茱萸樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值測(cè)定結(jié)果

2.5 各樣品吳茱萸中檸檬苦素含量測(cè)定

采用高效液相色譜法對(duì)吳茱萸中檸檬苦素進(jìn)行含量測(cè)定[2，5]。

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：[乙腈-四氫呋喃(25∶15)]-0.02% 磷酸溶液(35∶65)；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取檸檬苦素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含檸檬苦素0.104 mg的混合溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取各吳茱萸樣品粉末(過三號(hào)篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，對(duì)照品及1號(hào)樣品的色譜圖見圖2。

根據(jù)峰面積計(jì)算各樣品吳茱萸中檸檬苦素含量，結(jié)果見表6。

注：A.檸檬苦素對(duì)照品；B.1號(hào)樣品；1.檸檬苦素.圖2 吳茱萸樣品及對(duì)照品HPLC圖

表6 各吳茱萸樣品中檸檬苦素含量測(cè)定

2.6 相關(guān)性分析

對(duì)吳茱萸各樣品中非腺毛的顯微特征常數(shù)(X)與檸檬苦素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)(Y)做線性相關(guān)性分析，其結(jié)果：Y=0.006X-3.063，r=0.936，F(xiàn)=42.200，P=0.001；P<0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果表明，吳茱萸中檸檬苦素含量與各樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值有相關(guān)性(P<0.01)，且呈正相關(guān)，即樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值愈大，檸檬苦素含量愈大。

《中國藥典》2015年版規(guī)定：吳茱萸按干燥品計(jì)算，含檸檬苦素(C26H30O8)不得少于0.20%。根據(jù)所得到的回歸方程可知，含量達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值應(yīng)不少于543.83個(gè)·mg-1。

3 討論

根據(jù)優(yōu)化的顯微定量法，吳茱萸中檸檬苦素含量與各樣品中非腺毛顯微特征常數(shù)值的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在未提取的前提下，通過測(cè)定不同吳茱萸樣品中的非腺毛的顯微特征常數(shù)大小，可以判斷藥材吳茱萸質(zhì)量的優(yōu)劣。根據(jù)所得到的回歸方程可知，含量達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值應(yīng)不少于543.83個(gè)·mg-1。因此，可以通過測(cè)定吳茱萸粉末中非腺毛的顯微特征常數(shù)值，即數(shù)值大于543.83個(gè)·mg-1，即可滿足《中國藥典》規(guī)定的吳茱萸質(zhì)量。

經(jīng)過優(yōu)化的顯微定量法，科學(xué)、簡(jiǎn)便，可以作為化學(xué)方法的補(bǔ)充來控制中藥質(zhì)量。本研究為中藥的質(zhì)量鑒定開辟了新的研究方法，為中藥質(zhì)量檢測(cè)體系進(jìn)行了有益的充實(shí)。筆者建議《中國藥典》對(duì)化學(xué)含量及顯微特征常數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的中藥增加顯微特征常數(shù)值檢測(cè)方法。

[1] 康廷國.中藥鑒定學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：351.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：171.

[3] 陳聰慧，康廷國.金銀花顯微特征常數(shù)與化學(xué)成分相關(guān)性研究[J].中藥材，2011，34(9)：1373-1376.

[4] 劉明芝，周仁郁.中醫(yī)藥統(tǒng)計(jì)學(xué)與軟件應(yīng)用[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：312.

[5] 劉湘丹，蔡嘉洛，鄒君華，等.吳茱萸及其炮制品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、和檸檬苦素成分含量對(duì)比分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，22(3)：39-41.