野薔薇根總黃酮的提取及純化工藝△

李開言，張飛，田萍，馬開，王艷艷，李鳴，王軍*

(1.河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008)

野薔薇根(Rosa multiflora Thunb)，是薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa植物多花薔薇的干燥根皮。其藥性苦、澀、寒，無毒；歸脾、胃、腎經；是清熱、燥濕、活血的收斂藥。具有清熱解毒、祛風除濕、活血調經、固精縮尿、消骨鯁等功能。研究發現，野薔薇中總黃酮含量豐富，尤其是根皮中含量最高[1]。研究文獻發現，野薔薇及其變種中含有二氫黃酮(醇)[2]、山柰酚[3]、槲皮素[4]、二氫槲皮素[5]、蘆丁[4]、兒茶精[1]、金絲桃苷[6]、查耳酮[7]等豐富的黃酮類成分，這些成分具有抗氧化、降血脂、抑制血栓形成等治療動脈粥樣硬化的功能。在臨床上利用其注射液治療高血脂并伴有高血壓癥的患者，有明顯的降血脂、降血壓功能[8]。大量的體內外研究也發現，黃酮類化合物具有良好的改善心腦血管疾病的療效[9]。本實驗主要是探究野薔薇根總黃酮的提取純化工藝，為今后的藥物開發做準備。

大孔吸附樹脂具有大孔網狀結構，且孔徑與比表面積都比較大，是一種高分子聚合物，不溶于水、酸、堿及乙醇、丙酮、烴類等有機溶劑，具有較高的耐酸、耐堿、耐氧化能力，對熱穩定性強[10]。不同極性和含不同官能團的樹脂對各類化合物的吸附解吸能力不同，因此需要根據有效成分純化的要求，選擇不同型號的樹脂[11]。大孔吸附樹脂具有價格低廉、可再生利用、操作簡單、對有機成分選擇性較高、吸附性能好等優點，適合于中藥和天然藥物中有效成分的分離、純化，對促進中藥現代化具有重要的作用[12]。

1 儀器與試藥

紫外分析儀UV-265FS(SHIMADZU)；超聲波清洗器SB-5200DT(寧波新芝生物科技股份有限公司)；旋轉蒸發器RE-2000(鞏義市英峪高科儀器廠)；循環水真空泵SHB-Ⅲ型(鞏義市英欲儀器廠)；低溫冷卻循環泵DLSB-5/20 ℃(鄭州凱鵬實驗儀器有限公司)；萬分之一天平L-160DTP(LIBROR)。

野薔薇根購于安徽亳州藥材市場，粉碎，過60目篩。

蘆丁(HPLC≥98%，上海哈靈生物科技有限公司)；HP-20、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600、HPD-722、HPD-826、AB-8、D-101、D-140、D-301、DM-130、NKA-900大孔樹脂(勤實科技)；所用試劑均為分析純。

2 實驗內容

試用70%乙醇溶液作為提取劑，對野薔薇根粉末進行提取，過濾，乙醇溶液回收，濃縮至浸膏狀，于冰箱中4 ℃保存備用。

2.1 黃酮的定性鑒別

鹽酸-鎂粉實驗、三氯化鋁實驗、濃氨水實驗均呈現陽性，故可判定野薔薇根提取物中含有黃酮類化合物。

2.2 標準溶液的制備及標準曲線的繪制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取于180 ℃干燥至恒重的無水蘆丁4.43 mg，用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中，超聲混合均勻，便制得蘆丁對照品溶液，備用。

2.2.2 吸收波長的選擇 分別取適量對照品溶液和野薔薇根醇提液，再依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，靜置6 min；10%硝酸鋁溶液0.4 mL，靜置6 min；1 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，靜置15 min；70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻。在400～800 nm波長范圍掃描，對照品和野薔薇根醇提物最大吸收波長分別為508.0、498.6 nm，見圖1。以對照品最大吸收波長為準，最終選擇檢測波長為508 nm。

圖1 400～800 nm紫外吸收光譜圖

2.2.3 標準曲線的繪制 分別精密量取不同體積蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照2.2.2步驟中10 mL反應體系配制溶液，于508 nm處用紫外分光光度法測定各濃度的吸光度。

表1 不同質量濃度蘆丁對照品溶液的吸光度測定

以蘆丁對照品溶液的質量濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析，得到回歸方程：Y=7.804X+0.180 4，r=0.999 5。

2.3 野薔薇根總黃酮的粗提取

2.3.1 提取條件的正交試驗設計 在進行野薔薇根總黃酮回流提取時，保持沸騰溫度95 ℃，考察野薔薇根總黃酮提取時乙醇溶液的濃度、料液比、提取時間3個因素，每個因素選擇3個水平進行L9(34)正交設計(見表2)，以野薔薇根中總黃酮的含量(檢測方法如2.2.2)和收膏率(將各組提取液移至已干燥稱重的蒸發皿中水浴蒸干，迅速置干燥器中放冷，稱重，計算干膏重量)為評價指標，公式(1)計算總黃酮含量，公式(2)計算收膏率，來選擇最適提取條件(見表3)。

總黃酮含量(%)=CVn/1000 m

(1)

收膏率(%)=(干膏質量/生藥質量)×100%

(2)

式中：C為樣品溶液中總黃酮的質量濃度g·L-1；V為提取液稀釋定容體積mL；n為稀釋倍數；m是野薔薇根生藥粉末的質量g。

表2 野薔薇根總黃酮提取工藝因素水平

表3 正交試驗結果

注：D為空白組； K1、K2、K3為每個因素各個水平下的指標總和；R為極差=平均含量最大值-平均含量最小值。

通過表3直觀分析可知，以總黃酮含量和收膏率為指標，各因素影響程度均為A>B>C，A的影響最大。提取條件為組合A1B3C3時，總黃酮含量49.056%，收膏率11.41%；提取條件為組合A1B2C2時，總黃酮含量為47.219%(略低于49.056%)，收膏率12.85%(略高于11.41%)；考慮到組合A1B2C2的成本較低，提取時間較短，乙醇溶劑用量較少，方便后期的濃縮處理，故選擇組合A1B2C2為野薔薇根總黃酮最佳提取條件。在正交試驗前已做過乙醇濃度、料液比、提取時間的單因素試驗，發現采用溶劑為體積分數30%、40%乙醇提取野薔薇根得到的總黃酮含量(42.107%、37.804%)均低于50%乙醇提取的總黃酮含量(48.936%)；料液比1∶20(49.036 %)比料液比1∶15(48.936%)得到的總黃酮含量略高，但成本增加較多；提取時間2.5 h(49.107%)與提取時間2 h(48.936%)得到的總黃酮含量基本相同，但提取時間3 h得到的總黃酮含量(44.209%)下降，可能是持續高溫提取破壞了部分溶劑中的黃酮。

2.3.2 粗提取 稱取1 kg藥材粉末，按照2.3.1最佳提取條件提取3次，藥液經過濾后，在旋轉蒸發儀上進行乙醇回收，濃縮成浸膏，放冰箱中4 ℃封口保存，以備用。

2.4 野薔薇根總黃酮的純化

2.4.1 大孔樹脂的篩選

2.4.1.1 大孔樹脂靜態吸附與解吸 將14種大孔樹脂分別用95%的乙醇浸泡12 h，充分溶脹后各準確稱取1.00 g，加入一定濃度的野薔薇根總黃酮提取液30 mL，靜置吸附24 h，測定未吸附藥液中總黃酮濃度。小心傾掉未吸附的藥液，用大量去離子水洗至澄清，淋干。加入40 mL 50%乙醇溶液，置于搖床上60 r·min-1解吸4 h，測定解吸液中總黃酮濃度，結果見表4。

吸附量=上樣液濃度×上樣液體積-流出液濃度×流出液體體積

(3)

(4)

(5)

綜合野薔薇根總黃酮的靜態吸附率和解吸率，從中篩選出HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型號的大孔樹脂來進一步選擇。

表4 靜態吸附率、解吸率的測定

2.4.1.2 動態解吸能力的考察 采用動態吸附法，通過測定洗脫液中總黃酮的含量來計算解吸率以篩選出最合適的樹脂型號。分別準確稱取已充分溶脹的HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型大孔吸附樹脂5.00 g，濕法裝柱，用大量去離子水沖洗至無醇味，備用。分別加入50 mL藥液上樣，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。用大量去離子水進行水洗除雜，直至流出液澄清透明無顏色。再各加入40 mL 50%乙醇(相當于5倍柱體積)溶液洗脫，流出液定容至40 mL，UV508 nm檢測流出液中總黃酮含量，結果如表5。

表5 動態解吸液總黃酮含量的測定

綜合靜態吸附、解吸和動態解吸能力的考察，選用HPD-400型號的大孔吸附樹脂為最佳純化樹脂柱。

2.4.2 野薔薇根總黃酮純化因素考察

2.4.2.1 上樣濃度的考察 取浸膏37.5 g，去離子水溶至250 mL，過濾配成母液。母液分別稀釋為1倍、1.5倍、2倍、2.5倍各原液。濕法裝柱，用大量去離子水沖洗至無醇味。準確量取各原液40 mL上樣，UV508 nm檢測各原液和未吸附液吸光度，見表6。

表6 上樣濃度的考察測定

綜合對不同濃度藥液中總黃酮吸附率的考察，可知稀釋1.5倍的濃度是最佳上樣濃度。

2.4.2.2 最大上樣量的考察 將母液稀釋為1.5倍的原液，備用。分別準確量取原液25、30、35、40 mL上樣，UV508 nm檢測不同體積原液上樣后未吸附液吸光度，見表7。

表7 最大上樣量的考察測定

注：“—”為原液不經純化處理。

綜合不同上樣體積時藥液中總黃酮吸附率的考察，可知35 mL是最大上樣量。

2.4.2.3 上樣流速的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速分別為1.5、2、3、6 s/滴，UV508 nm檢測不同流速狀態下未吸附液吸光度，見表8。

表8 上樣流速的考察測定

注：“—”為原液不經純化處理。

綜合不同上樣流速時藥液中總黃酮吸附率及效率的考察，可知3 s/滴是最佳上樣流速。

2.4.2.4 除雜用水量的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后分別用24、32、40、48 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子。UV508 nm檢測不同體積去離子水除雜物中總黃酮吸光度，見表9。

表9 除雜用水量的考察測定

注：“—”為原液不經純化處理。

綜合對不同體積去離子水除雜時廢液中總黃酮含量的考察，可知使用40 mL去離子水有除雜的最好效果。

2.4.2.5 洗脫液濃度的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再分別用40%、50%、60%、70%的乙醇溶液洗脫。UV508 nm檢測不同濃度洗脫液中總黃酮吸光度，見表10。

表10 洗脫液濃度的考察測定

注：“—”為原液不經純化處理。

綜合對不同濃度乙醇進行洗脫時洗脫液中總黃酮含量的考察，可知50%乙醇溶液為最佳洗脫液濃度。

2.4.2.6 洗脫液用量的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液各24、32、40、48 mL進行洗脫。UV508 nm檢測不同濃度洗脫液中總黃酮吸光度，見表11。

表11 洗脫液用量的考察測定

注：“—”為原液不經純化處理。

綜合對不同體積50%乙醇溶液進行洗脫時洗脫液中總黃酮含量的考察，可知32 mL 50%乙醇溶液為最佳洗脫液用量。

2.4.2.7 洗脫速率的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再分別控制用32 mL 50%的乙醇溶液1.5、2、3、6 s/滴的速度進行洗脫。UV508 nm檢測不同流速狀態下洗脫液中總黃酮吸光度，見表12。

表12 洗脫液流速的考察測定

綜合對32 mL 50%乙醇溶液不同流速進行洗脫時洗脫液中總黃酮含量的考察，可知2 s/滴為最佳洗脫液速率。

2.4.2.8樹脂重復使用次數的考察 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL進行洗脫，流速為2 s/滴。UV508 nm檢測未吸附液中總黃酮及洗脫液中總黃酮吸光度，柱子重復4次使用，見表13。

表13 樹脂重復使用次數的考察測定

綜合對樹脂重復使用次數的考察數據，知樹脂可以重復使用3次，第4次使用吸附性能下降。

2.4.2.9 純化工藝的驗證 準確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當藥液沒過樹脂約一指時，關閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL進行洗脫，流速為2 s/滴。UV508 nm檢測未吸附液中總黃酮及洗脫液中總黃酮吸光度，做3個平行試驗：

表14 純化工藝的驗證

綜合3次平行試驗結果分析，該提取工藝可進行重復性操作，純化的總黃酮達到50%以上。

3 討論

黃酮的定性鑒別實驗中，觀察到鹽酸-鎂粉反應空白管和反應管兩管均呈紅色，可以說野薔薇根總黃酮中含有花色素成分。正交試驗結果分析中，可知乙醇溶液的濃度對野薔薇總黃酮的提取影響較大。在動態吸附過程中，柱子中裝有的棉花對實驗的結果存在著一定的影響；不同時間操作對實驗的結果也會造成影響。每兩項內容實驗的結果會有較大些的偏差，但每一項內容的實驗結果偏差較小，結果趨勢明顯。

結合實驗的高效性和經濟性，該提取工藝和純化工藝值得推廣，可為今后開發利用野薔薇根提供簡便快捷的方法途徑。

[1] 王玲，康俊麗，尚路遙，等.野薔薇不同部位總黃酮含量比較研究[J].中醫學報，2015，30(9)：1332-1334.

[2] 梁坤.刺玫薔薇莖中黃酮苷元提取、純化及抗氧化活性的研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2009.

[3] 朱珊，劉岱琳.薔薇屬植物中的化學成分和藥理作用研究概況[J].天津藥學，2010，22(4)：49-54.

[4] 迪麗努爾·馬力克，毛居代·亞爾買買提，阿孜古麗·木阿賽力木，等.反相液相色譜法測定新疆野薔薇果中的黃酮類化合物[J].食品科學，2010，31(12)：156-158.

[5] 王萍，賈斌.刺玫薔薇莖中二氫槲皮素的提取工藝研究[J].食品工業科技，2008，29(3)：196-198.

[6] 米麗班·霍加艾合買提，迪麗菲嘎爾·阿布都熱一木，迪麗努爾·馬里克.HPLC法測定野薔薇中金絲桃苷的含量[J].食品研究與開發，2011，32(7)：114-116.

[7] 李延芳，胡立宏，樓鳳昌.野薔薇根化學成分的研究[J].中國藥學雜志，2003，38(5)：336-338.

[8] 陳家暢.野薔薇根注射液對實驗性動物心肌壞死保護作用的初步研究[J].河南中醫學院學報，1979(2)：44-46.

[9] 俞靜靜，蘇潔，呂圭源.陳皮抗心腦血管疾病相關藥理研究過程[J].中草藥，2016，47(17)：3127-3132.

[10] 羅顯華，郁建生.大孔吸附樹脂分離純化草珊瑚總黃酮的工藝研究[J].時珍國醫國藥，2007，18(11)：2703-2706.

[11] 李崇明，熊富良，黃志軍，等.新藥研究中大孔樹脂型號與規格的選擇應用[J].中成藥，2008，30(8)：1208-1210.

[12] 屠鵬飛，賈存勤，張洪全.大孔吸附樹脂在中藥新藥研究和生產中的應用[J].世界科學技術—中藥現代化，2004，6(3)：22-28.