響應(yīng)面法優(yōu)化天麻多糖的超聲提取工藝△

馬彥江，于蘭蘭，劉瑞霞，陳天朝*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院省級(jí)中藥炮制技術(shù)傳承基地，河南 鄭州 450000；3.河南省直第三人民醫(yī)院 藥劑科，河南 鄭州 450006；4.中牟縣中醫(yī)院 藥劑科，河南 中牟 451450)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。味甘，性平，歸肝經(jīng)。具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)之功能[1]。天麻含有天麻素、天麻苷元(對(duì)羥基苯甲醇)、天麻多糖、對(duì)羥基苯甲醛、檸檬酸、檸檬酸單甲酯、谷甾醇等，天麻多糖能有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，具有抗炎、延緩衰老、抗輻射、降低血壓的作用[2]。超聲提取技術(shù)作為一種新型中藥提取技術(shù)，具有省時(shí)、高效、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，已在中藥提取中廣泛應(yīng)用[3]。響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)是集試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)和最優(yōu)化技術(shù)于一體的綜合應(yīng)用方法[4]。與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法具有精度高、次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)，且能反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[5-6]。故本實(shí)驗(yàn)以天麻多糖提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)天麻的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為天麻的深入開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；SG3300型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DZKW-C電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司)；Sartorius CP225D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；LXJ-ⅡB離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料

天麻藥材購(gòu)自安徽石田中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥檢室檢驗(yàn)，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒽酮-硫酸法測(cè)定天麻多糖的含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品2.77 mg，加無(wú)水乙醇定容至25 mL容量瓶中，即得對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液(精密稱(chēng)取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸100 mL溶解，搖勻)6 mL，搖勻，置100 ℃水浴中，加熱15 min，再放入冰水浴中冷卻15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。得回歸方程Y=37.906X-0.029(r=0.999 4，n=7)，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.002 8～0.019 4 mg·ml-1線性關(guān)系良好。

2.1.2 樣品前處理 將天麻塊莖在75 ℃時(shí)減壓干燥后將其粉碎，過(guò)80目篩，精密稱(chēng)取藥材細(xì)粉1 g，加入一定量的水，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，離心，上清液用三氯甲烷-正丁醇(3∶2)萃取2次，水層加4倍量95%乙醇，放入冰箱靜置過(guò)夜，濾過(guò)，殘?jiān)靡掖肌⒈⒁颐岩来蜗礈欤稍铮吹锰炻榇侄嗵恰?/p>

2.1.3 多糖含量的測(cè)定 采用蒽酮-硫酸法[7-8]，將所得的天麻粗多糖加蒸餾水定容至50 mL，再精密吸取1 mL溶液，加蒸餾水定容至25 mL得樣品溶液。精密吸取1 mL置于10 mL試管中。按2.1.1項(xiàng)下操作，測(cè)定供試液的吸光度值，用下式計(jì)算天麻多糖提取率：

多糖提取率=[樣品濃度(mg·mL-1)×樣品體積(mL)×定容體積]/[樣品質(zhì)量(g)×103]×100%

(1)

2.2 單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-13]，選定超聲提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)和液固比3個(gè)影響因素作為考察對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)置5水平，以天麻多糖的超聲提取率為指標(biāo)，初步考察各影響因素。

2.2.1 提取溫度對(duì)天麻多糖提取率的影響 設(shè)置固定液固比為20∶1，超聲提取60 min，考察不同的提取溫度對(duì)天麻多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。可知，在40～70 ℃，提取率隨溫度上升顯著提高，但當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，提取率增加不明顯，考慮到高溫對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及活性的影響，提取溫度選定為70 ℃。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)天麻多糖提取率的影響 設(shè)置固定液固比為20∶1，提取溫度為60 ℃，考察不同的提取時(shí)間對(duì)天麻多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。可知，在45 min內(nèi)，提取時(shí)間的增加，提取率隨之提高，但超過(guò)45 min后，提取率呈逐漸下降趨勢(shì)。這可能是提取時(shí)間的增加，部分多糖被破壞降解。故提取時(shí)間選定為45 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)天麻多糖提取率的影響

2.2.3 液固比對(duì)天麻多糖提取率的影響 設(shè)置固定提取時(shí)間60 min，提取溫度為60 ℃，考察不同料液比對(duì)天麻多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

可知液固比為15∶1時(shí)，天麻多糖提取率明顯大于液固比為10∶1與5∶1時(shí)；與20∶1和25∶1時(shí)相比，差異不大。故液固比選定為15∶1。

圖3 液料比對(duì)天麻多糖提取率的影響

2.3 運(yùn)用中心組合試驗(yàn)優(yōu)化前處理?xiàng)l件

根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[3，5-6]，以超聲提取溫度(X1)、超聲提取時(shí)間(X2)、液固比(X3)3個(gè)因素為自變量，天麻多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(14個(gè)為析因試驗(yàn)，3個(gè)為中心試驗(yàn))。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選定各響應(yīng)面因素水平，見(jiàn)表1，響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 模型方程的建立與方差分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程：Y=17.17+0.59X1+0.61X2+0.72X3-0.54X1X2-2.14X1X3+

0.37X2X3-1.69X12-4.23X22-3.66X32。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 響應(yīng)面因素水平表

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

表3 天麻多糖方差分析結(jié)果

注：***表示P<0.001，差異極顯著；**表示P<0.01，差異高度顯著；*表示P<0.05，差異顯著。

由表3可知，一次項(xiàng)中提取時(shí)間(X2)、液固比(X3)對(duì)多糖提取率的線性效應(yīng)顯著，各因素對(duì)多糖提取率的影響大小為X3>X2>X1；二次項(xiàng)中提取時(shí)間(X2)、液固比(X3)對(duì)多糖提取率的線性效應(yīng)極顯著，提取溫度(X1)對(duì)多糖提取率的線性效應(yīng)高度顯著；交互項(xiàng)中提取溫度與液固比(X1X3)對(duì)多糖提取率的線性效應(yīng)極顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.981 2，說(shuō)明該模型能夠98.12%反映相應(yīng)值隨自變量的變化，模型擬合程度較好。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，回歸方程的失擬項(xiàng)檢測(cè)P<0.000 1，極顯著；回歸方程顯著性檢測(cè)P<0.000 1，極顯著，證明響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取工藝提取天麻多糖是可行的。

2.5 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。天麻多糖超聲提取的二維等高線圖與響應(yīng)曲3D圖譜見(jiàn)圖4。

注：A.提取溫度與提取時(shí)間；B.提取溫度與液固比；C.提取時(shí)間與液固比。圖4 各因素對(duì)天麻多糖提取率影響的二維等高線和三維響應(yīng)面曲線圖

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得的天麻多糖超聲提取最佳工藝：提取溫度78.54 ℃、提取時(shí)間48.06 min、液固比16.04∶1，在此條件下天麻多糖提取率的預(yù)測(cè)值為17.25%。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對(duì)模型優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。考慮到實(shí)驗(yàn)的可行性與便捷性，選擇工藝參數(shù)：提取溫度78 ℃、提取時(shí)間48 min、液固比16∶1，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算天麻多糖提取率，求其平均值為17.22%。與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

3 討論

近年來(lái)對(duì)天麻的提取工藝研究主要有傳統(tǒng)水提取法、微波提取法、酶提取法、超聲提取法等。超聲提取與其他方法相比具有方法簡(jiǎn)便、提取溫度低、時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)[9，14]，同時(shí)避免了高溫高熱對(duì)中藥材生物活性的破壞，具有較好的抗氧化作用[15]。

本試驗(yàn)運(yùn)用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)天麻多糖超聲提取工藝的提取溫度、提取時(shí)間、液固比進(jìn)行考察，建立了超聲工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明是有效的。

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