正交試驗法優選益腎滌濁丸提取工藝△

彭愛娜，楊珊，田素英，3*

(1.廣東省肇慶市中醫院，廣東 肇慶 526060；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；3.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 中山 528458)

益腎滌濁丸是廣東省肇慶市中醫院的制劑，是廣東省名中醫梁宏正教授多年臨床的經驗方，由粉萆薢、琥珀、虎杖、澤瀉、甘草、黃柏等中藥組成，具有益腎補虛、清熱解毒、祛瘀散結、通癃滌濁等功能，主要用于治療前列腺炎等癥，臨床療效良好。為保證質量和療效，本實驗以鹽酸小檗堿含量和干膏得率為考察指標，采用正交試驗設計優選益腎滌濁丸的提取工藝，為進一步開發利用該制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；HT-220A 型柱溫箱(天津市恒奧科技發展有限公司)；萬分之一電子天平(德國Sartorus公司，CP225D)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200B，150 W)。

1.2 材料

鹽酸小檗堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201610)；磷酸二氫鉀(天津市福晨化學試劑廠，AR，批號：20160607)；甲醇(天津市百世化工有限公司，色譜純，批號：20160206)；乙腈(天津市百世化工有限公司，色譜純，批號：20160211)；95%乙醇(天津市百世化工有限公司，AR，批號：20160616)；超純水(屈臣氏)。

方中所用藥材經田素英副教授鑒定均符合2015版《中華人民共和國藥典》(一部)標準。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿對照品0.94 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得質量濃度為0.094 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存備用。

2.1.2 供試品溶液 水提溶液：取處方中藥材粉末10 g，加10倍量的蒸餾水浸泡1 h，加熱回流1.5 h，提取3次，將提取液濃縮得提取物，用甲醇溶解并定容成50 mL，從中精密量取5 mL用甲醇定容成25 mL，充分搖勻后4000 r·min-1離心30 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾得樣品溶液。

醇提溶液：將水提后所得的藥渣烘干后取10 g，加10倍50%的乙醇每次提取2 h，提取3次，將提取液濃縮得提取物，用甲醇溶解并定容成50 mL，從中精密量取5 mL用甲醇定容成25 mL，充分搖勻后4000 r·min-1離心30 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾得樣品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 取處方減去黃柏的中藥材粉末10 g，按2.1.2中水提溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2 數據處理

本正交設計試驗結果采用鹽酸小檗堿和干膏率進行綜合評分[1-2]，計算公式如下：

綜合評分=樣品小檗堿÷小檗堿最高含量×60%+樣品干膏率÷最大干膏率×40%

(1)

干膏率(%)=所提干膏質量÷每份藥材的質量×100%

(2)

2.3 色譜條件與系統適用性試驗

色譜條件為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相[3]：乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀水溶液(28∶72)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：345 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。可知鹽酸小檗堿的保留時間為21.0 min，理論板數不低于5000，分離度大于1.5，且陰性對照在鹽酸小檗堿相應保留時間處無干擾。見圖1。

注：A.鹽酸小檗堿對照品；B.供試品；C.缺黃柏陰性對照品。圖1 系統適用性色譜圖

2.4 線性關系考察

精密吸取一系列梯度濃度的對照品溶液，于345 nm處測定峰面積，以鹽酸小檗堿對照品溶液濃度為橫坐標，鹽酸小檗堿的峰面積為縱坐標，進行回歸分析，得鹽酸小檗堿回歸方程：Y= 54 489 627.36X+227 374.71，相關系數r= 0.999 7(>0.999 0)。結果表明，鹽酸小檗堿在0.009 4～0.094 0 mg·mL-1與峰面積呈良好線性關系。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察 精密量取2.1.1對照品溶液6份各20 μL，按2.3項下色譜條件重復進樣6次，測定鹽酸小檗堿峰面積。RSD=1.40%，表明精密度良好。

2.5.2 重復性考察 精密稱取處方中藥材粉末10 g，共6份，按2.1.2項下水提溶液制備法制備供試品溶液，連續進樣6 次，分別測定鹽酸小檗堿含量。結果RSD為2.49%，表明該方法具有較好的重復性。

2.5.3 穩定性考察 精密量取2.1.2的供試品溶液各20 μL，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，按上述色譜條件測定鹽酸小檗堿峰面積。結果RSD為2.87%，表明在室溫時供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取已知鹽酸小檗堿含量的處方中藥材粉末各5 g，共5份，分別準確加入0.662 0 mg對照品，按供試品溶液的制備方法操作，在上述色譜條件下測定，計算加樣回收率。平均回收率=100.19%，RSD=0.69%，結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率(n=5)

2.6 優選水提工藝

根據預實驗結果分別選取料液比、浸泡時間、提取次數和提取時間4個因素進行正交設計[4-5]。提取液按照2.1.2項下制備，在2.3色譜條件下進行測定，按照標準曲線測定鹽酸小檗堿含量；另取提取液10 mL測定干膏率，以鹽酸小檗堿含量和干膏率的綜合評分為指標，采用L9(34)正交表進行試驗，結果見表2～4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 水提工藝正交試驗結果表

表4 水提工藝正交方差分析

由表3分析可知，在水提過程中各因素作用次序為D>C>A>B，即提取次數>提取時間>料液比>浸泡時間。由表4方差分析可知，料液比、浸泡時間、提取時間、提取次數對提取率的影響都無顯著性(P>0.05)。由K值可知提取工藝以A2B3C2D3組合為佳，即料液比為1∶10，浸泡時間為60 min，提取時間為1.5 h，提取次數為3次。

2.7 醇提藥渣工藝優選

根據預實驗結果分別選取料液比、浸泡時間、提取次數和提取時間4個因素進行正交設計[4-5]。測定方法和考察指標同水提工藝研究，結果見表5～7。

表5 正交試驗因素水平表

表6 藥渣醇提工藝正交試驗結果表

表7 藥渣醇提工藝正交方差分析

由表6分析可知，在醇提藥渣過程中各因素作用次序為D>A>C>B，即提取次數>乙醇濃度>提取時間>料液比。由表7可知，乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數對提取率的影響都無顯著性(P>0.05)。提取工藝以A2B3C3D3組合為佳，即乙醇濃度為50%，料液比為1∶10、提取時間為2 h、提取次數為3次。

2.8 驗證實驗

按照水提工藝研究時所用的測定方法和考察指標，取3批益腎滌濁丸藥材，按照水提正交優選的最佳提取條件，按2.1.2方法制備供試品提取液，3個批次益腎滌濁丸水提的鹽酸小檗堿的平均質量分數為19.35 mg·g-1，干膏率為24.29%。將水提所得藥渣按醇提正交優選的最佳提取條件進行提取，鹽酸小檗堿的平均質量分數為16.56 mg·g-1，干膏率為13.84%。

3 討論

益腎滌濁丸主要用于治療前列腺炎，黃柏的主要有效成分為鹽酸小檗堿，含量高達3%以上，具有抗病原微生物[6]、抗炎、抗菌[7]等作用，可用于治療前列腺炎[8]，提高免疫能力[9-10]等。因此，選擇鹽酸小檗堿作為指標成分對提取工藝進行篩選。

益腎滌濁丸由粉萆薢、黃柏、琥珀、虎杖、澤瀉、甘草、丹參等16味藥材，由于處方藥味多，只選取鹽酸小檗堿含量作為考察指標不夠嚴謹，另選擇干膏率作為實驗的指標。

本實驗先采用常規的水煎法提取。為了更充分提取有效成分，且鹽酸小檗堿在醇類溶劑中有較好的溶解[10]，故將水煎所得藥渣進行以乙醇為溶劑的提取，這點在實驗結果中也有體現，醇提藥渣的9次正交試驗中鹽酸小檗堿最高的質量分數為16.558 8 mg·g-1，干膏得率也增加了一半，并且由正交試驗結果知，所用乙醇濃度為50%，經濟成本不高，且有效成分得以充分提取，這正是本實驗的創新之處。通過對益腎滌濁丸水提和醇提條件的優化，更好地進行質量標準的制定，使該處方更有效地用于臨床。

[1] 郭婷婷，嚴明明，郝婷婷，等.三黃前必治軟膠囊提取工藝[J].中國新藥雜志，2008，17(4)：314-317.

[2] 陳程.正交實驗法優選黃連中鹽酸小檗堿醇提工藝的研究[J].應用化工，2014，43(3)：483-487.

[3] 孫繼澤，趙珉，唐巖，等.前列益康膠囊水提取工藝的優選[J].長春中醫藥大學學報，2015，31(3)：472-474.

[4] 汪文來，趙紅霞，白衛國.清宮消炎栓中黃柏提取工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12(11)：4-5.

[5] 張紅梅，程雪梅，王長虹，等.黃連中生物堿提取工藝的正交試驗研究[J].中國醫藥工業雜志，2008，39(8)：588-590.

[6] 武婧，宋忠興，古川，等.星點設計-響應面法優化黃柏提取工藝研究[J].中國現代中藥，2015，17(9)：953-956，969.

[7] 李丹丹，江培，楊書美，等.黃柏的化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展[J].黑龍江醫藥，2014，27(3)：601-605.

[8] 賈金銘，薛慈民，張蜀武，等.前列安栓治療慢性前列腺炎的療效和安全性[J].中華男科學，2001，7(6)：417-419.

[9] 王秋紅，薛娟，曾偉民，等.關黃柏多糖對小鼠免疫功能的影響[G].//第十屆全國免疫學學術大會匯編.北京：中國免疫學會，2015，11.

[10] 高文學，劉斌.HPLC測定前列安通膠囊中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量[J].中國現代中藥，2013，15(11)：992-994.